王憲華，連杰，翁孝剛，王濤，王曉琳，胡俊鵬

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100；2河南省華隆生物技術(shù)有限公司；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

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不同途徑移植人臍帶間充質(zhì)干細胞在糖尿病大鼠胰腺組織中的定植效果比較

王憲華1，連杰2，翁孝剛3，王濤1，王曉琳1，胡俊鵬1

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100；2河南省華隆生物技術(shù)有限公司；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

目的比較經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)及胰腺被膜下輸注的人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)在糖尿病大鼠胰腺組織中的移植定植效果，探討hUCMSCs移植治療糖尿病的最佳途徑。方法 取采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素制備1型糖尿病(T1DM)大鼠42只，隨機分為模型尾靜脈組、模型肝實質(zhì)組、模型胰腺被膜組各6只，觀察尾靜脈組、觀察肝實質(zhì)組、觀察胰腺被膜組各8只。觀察尾靜脈組、觀察肝實質(zhì)組、觀察胰腺被膜組分別經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)、胰腺被膜下途徑注射hUCMSCs懸液0.4 mL，模型尾靜脈組、模型肝實質(zhì)組、模型胰腺被膜組分別經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)、胰腺被膜下途徑注射生理鹽水0.4 mL。各組均干預(yù)4周。取各組胰腺組織，采用HE染色法觀察組織病理學(xué)。采用RT-PCR法檢測胰腺組織胰島素mRNA表達，采用免疫組化法檢測胰腺組織胰島素蛋白表達。應(yīng)用MAB1281蛋白示蹤劑，采用免疫組化法檢測胰腺組織MAB1281蛋白表達，評價hUCMSCs定植示蹤情況。結(jié)果 模型各組胰島結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，胰島細胞數(shù)量減少，部分發(fā)生空泡變性，胰島邊緣炎性細胞浸潤明顯；觀察各組胰島結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥反應(yīng)較輕。觀察各組胰腺組織胰島素mRNA及蛋白表達量均高于模型各組(P<0.05)，觀察胰腺被膜組胰腺組織胰島素mRNA及蛋白表達量高于觀察尾靜脈組及觀察肝實質(zhì)組(P均<0.05)。模型各組及觀察肝實質(zhì)組均未見MAB1281蛋白陽性表達，觀察尾靜脈組及觀察胰腺被膜組均可見MAB1281蛋白陽性表達區(qū)域，且觀察胰腺被膜組表達高于觀察尾靜脈組(P<0.05)。結(jié)論 三種途徑移植hUCMSCs均可起不同程度的治療作用，胰腺被膜下注射效果最佳。

1型糖尿病；人臍帶間充質(zhì)干細胞；靜脈注射；用藥途徑;肝臟；胰腺；移植

1型糖尿病(T1DM)是由多因素引起胰島β細胞漸進性破壞、最終導(dǎo)致胰島素絕對缺乏的慢性自身免疫性疾病[1]，至今仍無法治愈[2]。最根本的治療方法是胰腺或胰島移植以恢復(fù)糖穩(wěn)態(tài)[3,4]。細胞療法被視為一種可治愈T1DM的治療方法，但因缺乏合適的供體來源而受到限制[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨髓、臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(MSCs)可逆轉(zhuǎn)T1DM[6,7]。人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)比骨髓源性MSC(BMSC)更易擴增、分化，其形態(tài)、免疫表型及多分化潛能等生物學(xué)特性與BMSC極為相似，是同種異源中較好的MSC來源[8,9]。目前國內(nèi)外對hUCMSCs單一移植途徑進行研究較多，而很少對全身或局部多種不同途徑治療DM模型鼠的效果進行對照研究，不同移植途徑對于hUCMSCs在胰腺組織定植的效果尚不明確。2014年12月～2015年10月，我們對糖尿病大鼠分別經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)及胰腺被膜下三種途徑輸注hUCMSCs，觀察其在胰腺組織中的移植定植效果，為研究hUCMSCs治療糖尿病的最佳途徑提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料清潔級6周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量150～170 g，由河南省實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma 公司)；MSC檢測試劑盒(美國 BD公司)；小鼠抗Insulin抗體、大鼠胰島素ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；小鼠抗人細胞核抗體MAB1281(Millipore公司)；GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、Ex Taq?(Takara公司)。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 hUCMSCs的來源和鑒定hUCMSCs由河南省華隆生物技術(shù)有限公司提供。細胞經(jīng)需氧菌、厭氧菌及支原體等微生物檢測，微生物檢測結(jié)果均為陰性；經(jīng)流式細胞儀檢測間充質(zhì)干細胞表型包括CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90和CD105，細胞表型符合間充質(zhì)干細胞表型特征，符合國際細胞治療協(xié)會(ISCT)關(guān)于hUCMSCs表型的界定[10]。

1.3動物分組及模型制備大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選擇其中62只，采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg方法制備T1DM模型。以注射后第3、7、10天靜脈血糖水平均>16.7 mmol/L為造模成功[11]。剔除造模過程中死亡及血糖不達標(biāo)的大鼠，取造模成功大鼠42只，隨機分為模型尾靜脈組、模型肝實質(zhì)組、模型胰腺被膜組各6只，觀察尾靜脈組、觀察肝實質(zhì)組、觀察胰腺被膜組各8只。

1.4hUCMSCs移植取第3代hUCMSCs，用生理鹽水調(diào)整細胞濃度。觀察尾靜脈組、觀察肝實質(zhì)組、觀察胰腺被膜組分別經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)、胰腺被膜下途徑注射hUCMSCs懸液0.4 mL(含1×106個細胞)，模型尾靜脈組、模型肝實質(zhì)組、模型胰腺被膜組別經(jīng)尾靜脈、肝實質(zhì)內(nèi)、胰腺被膜下途徑注射生理鹽水0.4 mL。共干預(yù)4周。

1.5胰腺組織hUCMSCs定植效果觀察

1.5.1胰腺組織病理學(xué)觀察麻醉大鼠后開腹、開胸，進行心臟灌注固定后，剪取胰腺組織放至10%中性甲醛固定液中。制備胰腺組織石蠟切片，行HE染色，觀察胰腺組織病理變化。

1.5.2胰腺組織胰島素mRNA表達檢測采用RT-PCR法。提取胰腺組織RNA，設(shè)計人及大鼠胰島素RNA引物，片段長度均為200 bp，使用RNAiso試劑提取胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Ex Taq?進行PCR反應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描，采用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果用靶基因與內(nèi)參條帶灰度值比值表示。

1.5.3胰腺組織胰島素蛋白表達檢測采用免疫組化法。取胰腺組織，甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟至水；加入H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加正常山羊血清工作液封閉，室溫15 min，PBS沖洗。依次加入一抗小鼠抗Insulin抗體、HRP標(biāo)記聚合物，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。選擇切片陽性表達最明顯的區(qū)域，在40×10倍視野下，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0計算視野內(nèi)陽性細胞的平均光密度(OD)值。胰島素陽性細胞細胞核呈藍色，周圍染色呈棕黃色或棕褐色。

1.5.4胰腺組織定植示蹤檢測采用免疫組化法。應(yīng)用MAB1281蛋白示蹤劑，檢測胰腺組織MAB1281蛋白表達進行hUCMSCs定植示蹤。取胰腺組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟至水；加入H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加正常山羊血清工作液封閉，室溫15 min，PBS沖洗。依次加入一抗MAB1281單克隆抗體、HRP標(biāo)記聚合物，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。于高倍鏡下觀察同一切片的5個不同視野，每個視野計數(shù)100個細胞，記錄陽性細胞數(shù)量，計算陽性細胞表達率。MAB1281主要在細胞核表達，呈棕黃色。

2　結(jié)果

2.1胰腺組織病理學(xué)檢查模型各組胰島結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，胰島細胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞邊界不清，部分發(fā)生空泡變性，胰島邊緣炎性細胞浸潤明顯。觀察各組胰島結(jié)構(gòu)相對完整，胰島體積稍大，炎癥反應(yīng)較輕。

2.2各組胰腺組織胰島素mRNA表達比較模型尾靜脈組、模型肝實質(zhì)組、模型胰腺被膜組、觀察尾靜脈組、觀察肝實質(zhì)組、觀察胰腺被膜組胰腺組織胰島素mRNA表達量分別為0.296 2±0.037 5、0.280 1±0.027 3、0.313 6±0.044 7、0.645 6±0.059 9、0.547 2±0.053 2、1.005 5±0.094 5，觀察各組胰腺組織胰島素mRNA表達量高于模型各組(P<0.01)；觀察胰腺被膜組胰腺組織胰島素mRNA表達量高于觀察尾靜脈組及觀察肝實質(zhì)組(P均<0.01)。

2.3各組胰腺組織胰島素蛋白表達比較觀察各組胰島組織胰島素陽性面積大于模型各組，觀察胰腺被膜組胰島素陽性面積大于觀察尾靜脈組及觀察肝實質(zhì)組。

2.4胰腺組織定植示蹤結(jié)果模型各組及觀察肝實質(zhì)組均未見陽性表達，觀察尾靜脈組及觀察胰腺被膜組均可見陽性表達區(qū)域，且觀察胰腺被膜組大于觀察尾靜脈組。

3　討論

近年來，干細胞移植成為糖尿病治療研究領(lǐng)域的熱點。hUCMSCs作為一種從臍帶華爾通膠中分離培養(yǎng)獲得的成體干細胞，以較強的自我復(fù)制能力、多向分化潛能和較低的免疫原性備受關(guān)注[12]。多項研究表明，異種異體移植hUCMSCs能改善T1DM大鼠的高血糖狀態(tài)及相關(guān)微血管病變[11,13]。目前干細胞移植主要采用胰腺被膜下或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)、腎被膜下、肝實質(zhì)內(nèi)或肝門靜脈、尾靜脈等途徑注射。胰腺被膜下注射可使干細胞直接進入胰腺組織，準(zhǔn)確歸巢到胰腺等靶部位以達到較好的治療效果，但該器官位置隱蔽，對注射技術(shù)要求高；腎被膜下是免疫特許區(qū), 血供豐富，可使移植細胞逃避免疫攻擊，易于存活，但該部位不利于細胞分化。肝臟作為胰島素的效應(yīng)器官，有利于糖代謝調(diào)節(jié)，且其微環(huán)境更接近胰腺，溫度適宜，血供豐富，利于干細胞定植、存活，但腹部手術(shù)切口大，存在感染風(fēng)險；經(jīng)尾靜脈注射具有廣泛分布的潛能，可重復(fù)應(yīng)用并且創(chuàng)傷小，但干細胞通過其他組織器官的同時可能造成一定數(shù)量的破壞和局部分化，使得到達胰腺組織的干細胞數(shù)量較少。本課題組前期研究證實，hUCMSCs移植后糖尿病鼠血糖明顯下降、血漿胰島素水平增加，胰腺被膜下移植是hUCMSCs治療糖尿病的最佳途徑。Wang等[11]證實，尾靜脈輸注的hUCMSCs在糖尿病鼠肝臟和胰腺組織中定植，故本實驗選用胰腺被膜下、肝實質(zhì)內(nèi)、尾靜脈三種移植途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中，肝臟和胰腺具有同源性[14]，故肝臟部位較接近胰腺的組織微環(huán)境可能有利于干細胞定植、存活，使其在體內(nèi)環(huán)境下產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子等多種細胞因子，通過旁分泌作用與局部微環(huán)境影響，達到營養(yǎng)支持胰腺的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，模型各組胰島結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，胰島細胞數(shù)量減少，細胞邊界不清，部分發(fā)生空泡變性，而觀察各組胰島結(jié)構(gòu)相對完整，胰島體積稍大，炎癥反應(yīng)較輕，表明三種途徑移植hUCMSCs可在一定程度上修復(fù)受損胰島，減輕胰腺及外周組織的炎癥反應(yīng)，考慮經(jīng)胰腺被膜下途徑移植的hUCMSCs可遷移至胰腺組織內(nèi)，直接刺激胰腺組織內(nèi)的干細胞增殖，誘導(dǎo)內(nèi)源性胰腺干細胞分化為胰島β細胞；肝實質(zhì)內(nèi)移植的hUCMSCs可分泌多種細胞因子，改善胰腺微環(huán)境，促進體內(nèi)殘存胰島素β細胞的增殖、再生和修復(fù)；尾靜脈途徑移植的hUCMSCs雖因全身血液循環(huán)中肺毛細血管管徑較小導(dǎo)致其在各器官滯留，但仍有少量hUCMSCs到達胰腺和肝臟起治療作用。

Tsai等[15]研究證實，hUCMSCs能夠在體外分化為成熟的胰島樣細胞簇及胰島素分泌細胞，移植入糖尿病模型鼠后，可使血胰島素水平顯著提高、血糖水平顯著下降，考慮為分化細胞在胰腺組織進行分化，發(fā)揮代償受損組織和分泌胰島素的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察各組胰腺組織胰島素mRNA及蛋白表達量均高于模型各組，觀察胰腺被膜組胰腺組織胰島素mRNA及蛋白表達量均高于觀察尾靜脈組及觀察肝實質(zhì)組，表明胰腺被膜下移植hUCMSCs不僅可以保證胰腺局部hUCMSCs的數(shù)量，同時能使hUCMSCs直接、充分接觸胰腺受損的微環(huán)境，感受局部損傷刺激，使其在誘導(dǎo)下分泌細胞因子，發(fā)揮其修復(fù)、促分化、營養(yǎng)、支持以及免疫調(diào)節(jié)等作用，使胰島素表達增加，而肝實質(zhì)內(nèi)移植的hUCMSCs可分泌多種細胞因子，改善胰腺微環(huán)境，促進體內(nèi)殘存胰島素β細胞的增殖、再生和修復(fù)，進而促進胰島素分泌；對于尾靜脈途徑移植的hUCMSCs，因其于各器官滯留等原因，有少量hUCMSCs到達胰腺和肝臟等通過直接或間接途徑不同程度增加胰島素分泌。

綜上，考慮三種途徑移植的hUCMSCs在體內(nèi)環(huán)境下產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子等多種細胞因子，通過旁分泌作用與局部微環(huán)境影響，達到營養(yǎng)支持胰腺的功能；同時免疫因素參與其中，通過免疫調(diào)節(jié)作用減少因異常代謝所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，組織胰島β的漸進性破壞，同時減輕胰腺及外周組織的炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，提高外周組織對胰島素的敏感性，促進胰島素分泌增加。

對移植細胞進行示蹤可了解其是否在移植部位定植及存活。示蹤干細胞方法包括熒光染料標(biāo)記、核素標(biāo)記、Y染色體標(biāo)記、報告基因轉(zhuǎn)染等，但均面臨需移植前標(biāo)記細胞、熒光易淬滅、示蹤周期短或檢測復(fù)雜等弊端。MAB1281單克隆抗體屬于特異性抗人細胞核抗體，其陽性表達證明人類細胞于移植部位定植，目前國內(nèi)外關(guān)于該抗體在移植細胞示蹤中的應(yīng)用研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MAB1281單克隆抗體行免疫組化進行示蹤時，模型各組及觀察肝實質(zhì)組均未見陽性表達，觀察尾靜脈組及觀察胰腺被膜組均可見陽性表達區(qū)域，表明移植的hUCMSCs可于胰腺部位定植存活；觀察胰腺被膜組面積大于觀察尾靜脈組，表明胰腺被膜下移植可保證更多的hUCMSCs存活，而尾靜脈途徑移植的hUCMSCs因于各器官滯留等原因，到達胰腺的細胞較少，說明病灶局部移植hUCMSCs是較好的途徑。

綜上所述，經(jīng)胰腺被膜下、尾靜脈等途徑異種異體移植hUCMSCs細胞均可在大鼠體內(nèi)胰腺組織中存活，雖肝實質(zhì)內(nèi)移植hUCMSCs無在胰腺組織中定植證據(jù)，但上述三種途徑可增加胰腺組織的胰島素表達，其中經(jīng)胰腺被膜下移植是最佳的治療途徑，該途徑可保證hUCMSCs于病灶局部定植，明顯增加胰島素表達，從而為糖尿病治療研究提供實驗基礎(chǔ)。

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新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計劃項目(YJSCX20448Y)。

翁孝剛(E-mail: wengxiaogang@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.013

R587.1

A

1002-266X(2016)30-0043-03

2015-12-04)