史曉靜， 趙 琳， 王高頻， 陶貴周

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧錦州121001）

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羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀對抗大鼠缺血再灌注心肌炎癥反應(yīng)和凋亡

史曉靜， 趙 琳， 王高頻， 陶貴周

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧錦州121001）

摘要：目的 觀察羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷（MIRI）腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素-1（inter 1eukin-1，IL-1）、心肌細胞內(nèi)Caspases-3和NF-κB表達的影響，探討其心肌保護作用機制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機等分為4組，假手術(shù)組（生理鹽水5 mL/d）、缺血再灌注組（生理鹽水5 mL/d）、阿托伐他汀預(yù)處理組［阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］和羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組［羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］。灌胃7 d后，第8天制作大鼠在體心肌I/R模型，結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min后，各組術(shù)后分別應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標，HE染色觀察心肌組織病理學變化，用ELISA法檢測心肌中TNF-a和IL-1β濃度，Western b1ot檢測活化Caspase-3和NF-κB的表達。結(jié)果 與缺血再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組心功能指標、組織病理改變明顯改善（P＜0.05），羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組改善更顯著；與缺血再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a和IL-1β濃度明顯減少（P＜0.05），Caspases-3和NF-κB表達明顯減少（P＜0.05）；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a、IL-1β、Caspases-3及NF-κB表達減少更為明顯（P＜0.05）。結(jié)論 羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理明顯抑制炎癥反應(yīng)，減少細胞凋亡，減輕MIRI損傷，呈現(xiàn)加強的心肌保護作用，其機制可能與抑制心肌NF-KB表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：心肌缺血-再灌注損傷（MIRI）；羥基紅花黃色素A；阿托伐他汀；炎癥反應(yīng)；凋亡

心肌缺血再灌注損傷（myocardia1ischemia reperfusion injury，MIRI）在臨床上十分常見，病理生理過程復(fù)雜，其發(fā)生機制可能與多種因素有關(guān)，細胞凋亡可能是MIRI發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A和阿托伐他汀具有明顯的心血管保護作用，但二者合用是否可有相互增強作用及機制目前尚不明確。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 羥基紅花黃色素A（山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心，純度≥98％）；阿托伐他?。⑵胀?，輝瑞制藥有限公司，20 mg×7片/盒）；兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體，購自美國Ce11Signa1ing Techno1ogy公司；兔抗NF-κB多克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechno1ogy公司；二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔1gG抗體，購自美國Santa Cruz公司；內(nèi)參照物購自武漢博士德公司。

1.2 動物及分組 健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物合格證號SYXK（遼）2013-0005號。隨機分為假手術(shù)組（生理鹽水5 mL/d）、缺血-再灌注組（生理鹽水5 mL/d）、阿托伐他汀預(yù)處理組［（阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］和羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組［羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）］和阿托伐他?。?0 mg/（kg.d）］，每組10只。灌胃7 d后，第8天制作大鼠在體心肌I/R模型。

1.3 模型制備 參照相關(guān)文獻，采用阻斷大鼠冠狀動脈左前降支建立缺血再灌注損傷動物模型。將大鼠乙醚麻醉下仰位固定于手術(shù)臺，自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降支，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，其余各組均以0號線快速結(jié)扎左冠脈，缺血30 min后再次開胸，剪斷絲線使血流再通，復(fù)灌120 min后處死動物，取出心臟。所有大鼠術(shù)前禁食、禁飲，麻醉后氣管插管，接動物呼吸機控制呼吸；接好生理記錄儀；開放尾靜脈輸液；全程記錄和分析心電圖、心率（HR）的變化。

1.4 給藥方法 各組動物均于模型制作前7 d灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7次，A組和B組灌胃生理鹽水5 mL/kg，C組和D組分別灌胃阿托伐他?。?0 mg/（kg.d）（溶于生理鹽水中）］，D組腹腔注射羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）。

1.5 檢測指標 再灌注120 min后，各組術(shù)后分別應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標，HE染色觀察心肌組織病理學變化，每組大鼠應(yīng)用ELISA法檢測心肌中TNF-a和IL-1β濃度。試劑均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書進行。Western b1ot方法檢測活化Caspase-3和NF-κB的表達。

1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能指標 各組術(shù)后心率差異不顯著（P＞0.05）。與假手術(shù)組相比，缺血-再灌注組左心室收縮壓（1eft ventricu1ar systo1ic pressure，LVSP）及左心室射血分數(shù)（1eft ventricu1ar ejection fraction，LVEF）顯著降低，左心室舒張末壓（1eft ventricu1ar end diasto1ic pressure，LVEDP）顯著增高（P＜0.05）；與缺血-再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組LVSP及LVEF顯著增高，LVEDP顯著降低（P均＜0.05），羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組改善更明顯。見表1。

表1　各組大鼠心功能指標比較（±s）

表1　各組大鼠心功能指標比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與缺血-再灌注組比較，*P＜0.05；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，**P＜0.05

組別　LVSP/mmHg　LVEDP/mmHg　　心率次/min　LVEF/％假手術(shù)組150.2±3.2　1.7±0.2　342±10　82.56±3.80缺血-再灌注組　96.1±3.8#　11.2±2.0#　344±11　63.40±3.05#阿托伐他汀組　122.3±4.1*　4.8±1.6*　340±9　72.68±3.55*聯(lián)合組　146.8±4.4**　2.3±0.8**　341±7　79.86±4.15**

2.2 心肌組織病理學改變 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組心肌細胞排列整齊，肌纖維橫紋清晰，未見變性或壞死以及炎細胞浸潤。模型組細胞排列紊亂，明顯腫脹，肌纖維部分斷裂，橫紋模糊或消失，片狀壞死區(qū)細胞核碎裂或崩解，炎性浸潤明顯。阿托伐他汀預(yù)處理組心肌細胞排列較整齊，部分細胞水腫變性，肌纖維間隙水腫，偶見炎性細胞浸潤。羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組組心肌細胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，壞死和炎性癥象有所減輕，有效地對抗心肌細胞損傷。

2.3 炎癥因子變化 與假手術(shù)組比較，缺血-再灌注組大鼠TNF-a和IL-1β濃度明顯增加（P＜0.05）；與缺血-再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度明顯減少（P＜0.05）；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組減少TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度更為明顯（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠心肌TNF-a和IL-1β濃度變化（±s）

表2　各組大鼠心肌TNF-a和IL-1β濃度變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與缺血-再灌注組比較，*P＜0.05；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，▲P＜0.05

組別　　動物數(shù)　　劑量　TNF-a/（ng.mL-1）IL-1β/（ng.mL-1）假手術(shù)組10　-　5.70±1.54　1.33±0.13缺血-再灌注組　10　-　52.24±7.97#　12.96±1.28#阿托伐他汀組　10　20 mg/（kg.d）　25.42±4.18*　6.10±0.94*聯(lián)合組　10　　羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　17.07±3.86▲　3.16±0.41▲

2.4 Caspase-3蛋白表達 與假手術(shù)組比較，缺血-再灌注組Caspase-3蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與缺血-再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達明顯減少（P＜0.05）；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達減少更為明顯（P＜O.05）。見表3。

表3　各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達的變化（±s）

表3　各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達的變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與缺血-再灌注組比較，*P＜0.05；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，▲P＜0.05

Caspase-3假手術(shù)組組別　　動物數(shù)　　劑量1.08±0.06缺血-再灌注組　10　-　5.96±0.39#阿托伐他汀組　10　20 mg/（kg.d）　3.28±0.19*聯(lián)合組　10　　羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　 2.06±0.16 10　-▲

2.5 NF-κB表達 與假手術(shù)組比較，缺血-再灌注組NF-κB表達明顯增加（P＜0.05）；與缺血-再灌注組比較，阿托伐他汀預(yù)處理組NF-κB表達明顯減少（P＜0.05）；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組NF-κB表達減少更為明顯（P＜0.05）。見表4。

表4　各組大鼠心肌組織NF-κB表達的變化（±s）

表4　各組大鼠心肌組織NF-κB表達的變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與缺血-再灌注組比較，*P＜0.05；與阿托伐他汀預(yù)處理組比較，▲P＜0.05

組別　　動物數(shù)　　劑量NF-κB假手術(shù)組3.08±0.20缺血-再灌注組　10　-　10.86±0.61#阿托伐他汀組　10　20 mg/（kg.d）　6.02±0.59*聯(lián)合組　10　　羥基紅花黃色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　4.06±0.38 10　-▲

3 討論

研究顯示，心肌缺血再灌注損傷與炎癥因子產(chǎn)生、內(nèi)皮損傷、細胞凋亡及核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等機制有關(guān)。心肌缺血階段炎癥反應(yīng)即被激活，再灌注則明顯加劇了心肌的炎癥反應(yīng)。此病理生理過程激活機體炎癥細胞釋放大量促炎因子：如白介素-1（inter 1eukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及干擾素等并且調(diào)節(jié)特異性免疫細胞反應(yīng)，引起比原打擊更大損傷的炎癥反應(yīng)。而心肌缺血再灌注損傷便是炎癥反應(yīng)過度表達，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)共同參與的結(jié)果［2-6］。

細胞凋亡是缺血再灌注損傷后細胞死亡的主要方式。Caspase-3是啟動凋亡程序的關(guān)鍵蛋白酶。Cspase-3表達的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑2種凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)生的標志酶［7］。本研究表明，缺血再灌注組Caspase-3表達比假手術(shù)組明顯增加，提示缺血再灌注過程中出現(xiàn)了大量的細胞凋亡。

NF-κB是一種廣泛存在于多種不同細胞，具有調(diào)控細胞因子、化學因子及立早蛋白等功能的轉(zhuǎn)錄因子，是一個對氧化還原狀態(tài)敏感的轉(zhuǎn)錄因子，對炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細胞生存和增生都具有調(diào)節(jié)作用，是一個參與炎癥反應(yīng)新的作用靶點［8-9］。NF-κB的異常激活與心肌細胞凋亡有密切關(guān)系［10-11］。在本研究中，缺血再灌注組NF-κB表達明顯增加，提示其參與了缺血再灌注損傷的病理過程。

紅花是非常重要的中草藥，內(nèi)含紅色素和黃色素2種色素。紅花黃色素是從紅花花瓣中提取的天然色素，屬于查耳酮類化合物，具有擴張冠狀動脈血管、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制等多種藥理功能。羥基紅花黃色素A為紅花主要水溶性有效成分。阿托伐他汀具有抗炎、抗栓、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可能通過多種途徑及機制發(fā)揮抗氧化、抗凋亡等多種心肌保護作用［12］。本研究顯示I/R后大鼠收縮及舒張功能均受損，組織損傷嚴重，采用阿托伐他汀治療后LVSP、LVEDP、LVEF及組織結(jié)構(gòu)有所改善，聯(lián)合組改善效果更明顯。本實驗也證實阿托伐他汀組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度明顯減少；聯(lián)合組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度（P＜0.05）減少更為明顯。表明二者聯(lián)合能更有效降低心肌TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度，減輕炎癥反應(yīng)，減輕再灌注損傷。此外阿托伐他汀組Caspase-3表達明顯減少；聯(lián)合組Caspase-3表達減少更為明顯。表明二者聯(lián)合能更有效抑制心肌細胞凋亡。在本研究中還顯示，阿托伐他汀預(yù)處理能明顯減少NF-κB表達（P＜0.05），聯(lián)合組減少NF-κB表達效果更加明顯。提示二者聯(lián)合可能通過抑制NF-κB表達從而對抗炎癥反應(yīng)，降低心肌細胞凋亡，減輕再灌注損傷。

總之，細胞凋亡是缺血再灌注損傷中重要的病理生理機制，羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理能減輕心肌炎癥反應(yīng)，減少心肌細胞凋亡，改善心功能，二者聯(lián)合表現(xiàn)出更加明顯的心肌保護作用，其機制可能與抑制NF-κB表達有關(guān)。

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作者簡介：史曉靜（1973—），女，博士生，研究方向為冠心病和心律失常。Te1：13941622062，E-mai1：shixiaojing3000@163.com

收稿日期：2014-09-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.039

中圖分類號：R966

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0170-03