周運江， 王 虎， 李 麗， 隨何歡， 黃家君

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶400016）

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山柰酚對卵清蛋白誘導(dǎo)豚鼠過敏性鼻炎的保護作用

周運江， 王 虎， 李 麗， 隨何歡， 黃家君*

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶400016）

摘要：目的 研究山柰酚對卵清蛋白誘導(dǎo)的豚鼠過敏性鼻炎的保護作用。方法 將50只雄性豚鼠隨機分為5組，即正常組、卵清蛋白模型組、山柰酚（5 mg/kg）組、山柰酚（20 mg/kg）組、氯雷他定（2 mg/kg）組。除正常組和卵清蛋白模型組外，其余各組在造模成功后連續(xù)7 d給藥。通過記錄豚鼠抓鼻和打噴嚏次數(shù)，評價過敏性鼻炎的癥狀；ELISA試劑盒檢測豚鼠血清中組胺、免疫球蛋白IgE、腫瘤壞死因子TNF-a和白細胞介素IL-4的水平；HE染色觀察豚鼠鼻黏膜病理形態(tài)的改變；Western b1ot檢測鼻黏膜組織中TNF-a和IL-4的表達量。結(jié)果 山柰酚能明顯改善豚鼠過敏性鼻炎的癥狀（P＜0.05），降低血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平（P＜0.05），降低鼻黏膜組織中TNF-a 和IL-4的表達水平（P＜0.05）。在光鏡下觀察，山柰酚會明顯減少嗜酸性粒細胞的浸潤。結(jié)論 山柰酚對卵清蛋白誘導(dǎo)的豚鼠過敏性鼻炎具有良好的保護作用。

關(guān)鍵詞：山柰酚；卵清蛋白；過敏性鼻炎

過敏性鼻炎是一種常見的耳鼻咽喉科疾病。隨著全球工業(yè)化的發(fā)展其發(fā)病率在逐漸增加，目前這種疾病影響了全球大約30％的人口，并且它在兒童和青年人群中的患病率日益增加。除此之外，在這些患鼻炎病的人群中，20歲之前患病的概率高達80％［1］。過敏性鼻炎是由IgE介導(dǎo)的過敏性疾病，它主要發(fā)生在鼻黏膜部位。雖然過敏性鼻炎不會威脅到病人的生命安全，但是鼻癢、鼻塞、打噴嚏和流鼻涕等一系列的鼻炎臨床癥狀會嚴(yán)重影響到病人的生活質(zhì)量［2］?，F(xiàn)在有很多藥物包括抗組胺類、皮質(zhì)激素類、減充血劑和鼻內(nèi)抗膽堿類藥物被用來治療過敏性鼻炎，但是這些藥物的副反應(yīng)和較低的臨床效果仍然存在［3］。因此，找到更好的藥物來治療過敏性鼻炎已經(jīng)迫在眉睫。

最近，人們對于從藥用植物中所提取的具有生物活性的天然化合物來治療過敏性疾病的興趣日益增加［4］，其中所關(guān)注的焦點便是這些天然化合物的安全性和有效性問題。山柰酚（kaempfero1，結(jié)構(gòu)式見圖1）是一種從姜科植物山柰以及檀香科植物百蕊草（Thesium chinense Turcz）中所提取的黃酮類化合物，它廣泛存在于各種蔬菜和水果中。有研究表明，山柰酚具有抗腫瘤［5］、抗炎［6］和抗氧化［7］等多種作用。在本次實驗中，我們主要研究山柰酚對卵清蛋白誘導(dǎo)豚鼠過敏性鼻炎的保護作用。

圖1　山柰酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chem ical structure of kaemp ferol

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器 雄性豚鼠，體質(zhì)量（300±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號SCXK渝2012-0001；氯雷他定片（上海先靈葆雅制藥有限公司，批號國藥準(zhǔn)字H10970410）；山柰酚（Sigma，USA，批號K0133）；卵清蛋白（OVA，Sigma，USA，批號A5378）；組胺、IL-4、TNF-a和IgE ELISA試劑盒（C1oud-C1one Corp，USA，批號分別為CEA927Ge、SEA077Gu、SEA133Gu、SEA545Gu）；一抗TNF-a、IL-4、β-actin抗體（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，USA，批號分別為3707S、12227S、4967S）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZB-2301）；BCA蛋白濃度測定試劑盒增強型（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0010S）；ECL暗室化學(xué)發(fā)光試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0018）；電泳儀（Bio-Rad，USA）；倒置顯微鏡（O1ympus，Japan）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）；臺式高速冷凍離心機（Thermo，USA）；超聲波細胞破碎儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 豚鼠鼻炎造模 選擇豚鼠作為造模動物，具體步驟如下：配制0.5 mg/mL的卵清蛋白溶液和20 mg/mL的A1（OH）3溶液，兩者1∶1混合。用此混合液對豚鼠進行腹腔注射使其全身過敏（0.1 mL/豚鼠，2周，一周3次）。2周后，用卵清蛋白溶液（2 mg/mL）對豚鼠鼻腔進行局部刺激（0.05 mL/豚鼠，1周，1次/d）。根據(jù)行為學(xué)觀察確定造模成功以后，進行如下分組：正常組、OVA對照組、不同給藥劑量的山柰酚組、氯雷他定組。對豚鼠進行連續(xù)1周灌胃給藥（山柰酚5 mg/kg，山柰酚20 mg/kg，氯雷他定2 mg/kg），同時繼續(xù)用2 mg/mL的卵清蛋白溶液刺激豚鼠鼻腔（1次/d）。在這期間，正常組和卵清蛋白對照組只使用生理鹽水處理。

1.3 豚鼠鼻炎癥狀評價 在末次給藥，卵清蛋白溶液（2 mg/mL）對豚鼠鼻腔進行局部刺激以后，將豚鼠放入觀察籠中，觀察15 min，記錄各組豚鼠抓鼻和打噴嚏的次數(shù)。

1.4 檢測豚鼠血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平 在記錄完各組豚鼠抓鼻和打噴嚏的次數(shù)24 h以后，用10％的水合氯醛麻醉豚鼠，股動脈取血，靜置2 h，1 000 r/min、4℃下離心10 min，取上層血清。按照ELISA試劑盒操作方法，檢測豚鼠血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4水平。

1.5 鼻黏膜組織學(xué)形態(tài)評價 取豚鼠頭部，去除皮膚和組織，取出鼻中隔黏膜組織，浸泡在10％的福爾馬林中48 h固定，組織在流動的水中沖洗后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜中嗜酸粒細胞的浸潤情況。

1.6 Western b1ot檢測鼻黏膜中TNF-a和IL-4的表達 取豚鼠鼻黏膜組織，加入細胞裂解液，超聲細胞破碎儀低溫勻漿，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白質(zhì)的量。取30 μg的蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶室溫封閉2 h后，分別加入抗TNF-a、IL-4和βactin一抗溶液，4℃溫育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液，溫育2 h，ECL暗室化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析，采用Quantity One分析軟件分析條帶灰度值，蛋白表達相對值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 山柰酚對過敏性鼻炎豚鼠鼻部癥狀的影響圖2結(jié)果顯示，與正常組比較，卵清蛋白模型組豚鼠抓鼻（圖2A）和打噴嚏（圖2B）的次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與卵清蛋白模型組相比，低劑量、高劑量山柰酚組和氯雷他定組豚鼠抓鼻和打噴嚏的次數(shù)會明顯減少（P＜0.05）。

圖2　山柰酚對豚鼠鼻炎癥狀的影響Fig.2 Effects of kaempferol on nasal symptoms in ovalbum in-induced guinea pigs

2.2 山柰酚對過敏性鼻炎豚鼠血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4水平的影響 圖3結(jié)果顯示，卵清蛋白模型組血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4水平均顯著高于正常組（P＜0.01）。與卵清蛋白模型組比較，低劑量、高劑量山柰酚組和氯雷他定組豚鼠血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4水平會明顯降低（P＜0.05）。

2.3 山柰酚對過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常組豚鼠鼻黏膜中少見嗜酸性粒細胞，卵清蛋白模型組豚鼠鼻黏膜中有大量嗜酸性粒細胞，高劑量山柰酚組及氯雷他定組豚鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細胞明顯減少，結(jié)果見圖4。

2.4 山柰酚對過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4表達的影響 Western b1ot結(jié)果顯示，TNF-a和IL-4在正常組豚鼠鼻黏膜中的表達水平很低，卵清蛋白模型組豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4會顯著增加（P＜0.01）。與卵清蛋白模型組比較，低劑量、高劑量山柰酚組和氯雷他定組豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4會顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖5。

3 討論

過敏性鼻炎是由IgE介導(dǎo)，以Th2型過敏反應(yīng)為特征的一類過敏性疾病。過敏性鼻炎在發(fā)病的過程中主要涉及到鼻黏膜中嗜酸性細胞的浸潤、肥大細胞的聚集和T細胞的活化［8］。有研究表明［9］，肥大細胞在過敏性鼻炎的早期階段中發(fā)揮著非常重要的作用，當(dāng)特異性個體接觸到過敏原以后就會由IgE介導(dǎo)，與肥大細胞表面受體FcεRI進行結(jié)合，使肥大細胞脫顆粒釋放組胺、白三烯和細胞因子等相關(guān)炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)會產(chǎn)生鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等癥狀。過敏性鼻炎的晚期反應(yīng)階段主要是細胞性活動，由組胺和細胞因子活化的嗜酸性粒細胞是發(fā)揮主要作用的炎性細胞之一。同時，活化的Th2細胞所產(chǎn)生的細胞因子在誘導(dǎo)和維持過敏炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。晚期階段的癥狀和早期階段的癥狀基本相似，不同是這些癥狀會有不同程度的加重，并且伴隨鼻腔的充血和黏液的分泌。

圖3　山柰酚對豚鼠血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4水平的影響Fig.3 Effects of kaemp ferol on the serum levels of histam ine，IgE，TNF-a and IL-4 in ovalbum in-induced guinea pigs

圖4　山柰酚對豚鼠鼻黏膜組織病理形態(tài)的影響Fig.4 Effect of kaempferol on the histopathological changes of nasalmucosa in ovalbum in-induced guinea pigs

T細胞（Th1和Th2）在超敏反應(yīng)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它能夠識別抗原呈遞細胞。在正常的情況下，Th1細胞和Th2細胞是處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，這可以調(diào)節(jié)機體的免疫防御。當(dāng)Th1細胞和Th2細胞處于非動態(tài)平衡的狀態(tài)時，Th1或Th2細胞會出現(xiàn)過度的活化狀態(tài)。有研究表明，過敏性疾病主要是Th2型的過敏反應(yīng)［10］。在過敏性鼻炎的病理過程中，過敏原會誘導(dǎo)Th2細胞的增殖，使IL-4、IL-5、IL-9、IL-13的分泌增加，這些細胞因子會促進IgE的產(chǎn)生、嗜酸性粒細胞和肥大細胞的活化［11］。近年來，IL-4是研究較多的一種細胞因子，具有非常廣泛的生物學(xué)作用，同時IL-4對IgE的產(chǎn)生具有顯著的促進作用［12］。在本項研究中，作者觀察到山柰酚會明顯抑制過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中IL-4的表達，降低過敏性鼻炎豚鼠血清中IL-4 和IgE水平，抑制嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤。這表明，山柰酚能夠通過調(diào)節(jié)Th1和Th2淋巴細胞亞群的平衡來改善過敏性鼻炎的癥狀。

肥大細胞是過敏性鼻炎發(fā)生過程中最重要的細胞之一，它被過敏原激活脫顆粒以后，會釋放出組胺，隨后會分泌與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細胞因子［13-14］。組胺在過敏性鼻炎發(fā)病的過程中具有非常重要的作用，它會引起鼻黏膜中毛細血管的擴張、通透性增高、腺體分泌增加，進而造成局部黏膜水腫。促炎細胞因子TNF-a與過敏性鼻炎密切相關(guān)，它是重要的多功能促炎細胞因子，可以使血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子促進炎癥細胞的聚集，同時也可以刺激組胺，前列腺素等因子的釋放［15］。有研究表明［16-17］，當(dāng)鼻部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，鼻黏膜下TNF-a表達會明顯增加，同時血液中組胺和TNF-a的水平也會有一定程度的增加。本項研究中作者發(fā)現(xiàn)，山柰酚會明顯的減少過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中TNF-a的表達，同時降低血清中組胺和TNF-a的水平。這表明，山柰酚可以通過下調(diào)組胺和TNF-a水平改善過敏性鼻炎的癥狀。

綜上所述，山柰酚能夠降低卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性鼻炎豚鼠模型血清中組胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平，抑制鼻黏膜組織中TNF-a和IL-4的表達水平，減少鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞的浸潤，從而改善過敏性鼻炎的癥狀。這些表明，山柰酚對卵清蛋白誘導(dǎo)豚鼠過敏性鼻炎有很好的保護作用。

1.正常組 2.卵清蛋白模型組 3.山柰酚組（5 mg/kg） 4.山柰酚組（20 mg/kg） 5.氯雷他定組（2 mg/kg）1.norma1group 2.1ecithin group 3.kaempfero1group（5 mg/kg） 4.kaempfero1group（20 mg/kg） 5.Loratadine group（2 mg/kg）圖5　山柰酚對豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4表達的影響Fig.5 Effects of kaempferol on the expressions of TNF-a and IL-4 in ovalbum in-induced guinea pigs

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Protective effect of kaem p ferol against ovalbum in-induced allergic rhinitis in guinea pigs

ZHOU Yun-jiang， WANG Hu， LILi， SUIHe-huan， HUANG Jia-jun*
（Department of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology；Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the protective effect of kaempfero1against ova1bumin（OVA）-induced a11ergic rhinitis in guinea pigs.METHODS Fifty guinea pigswere random1y divided into five groups，inc1uding norma1 group，ova1bumin mode1 group，kaempfero1（5 mg/kg and 20 mg/kg）treated groups and 1oratadine （2 mg/kg）treated group.The drug groups were given drugs once dai1y via gavage for seven consecutive days. Norma1and ova1bumin mode1groupswere given sa1ine a1one on the same schedu1e.The numbers of rubbingmovement and sneezeswere recorded to eva1uate the symptoms of a11ergic rhinitis.The concentrations of histamine，IgE，TNF-a and IL-4 in serum weremeasured by ELISA assay.The histopatho1ogica1changes of nasa1mucosa were observed by 1ightmicroscope after HE staining.Western b1otwas emp1oyed to test the TNF-a and IL-4 expressions in nasa1mucosa.RESULTS Kaempfero1significant1y improved the symptoms of a11ergic rhinitis（P＜0.05），de-book=25,ebook=31creased the 1eve1s of histamine，IgE，TNF-a and IL-4 in serum（P＜0.05），and inhibited the expressions of TNF-a and IL-4 in nasa1mucosa（P＜0.05）.In addition，kaempfero1marked1y reduced the infi1tration of eosinophi1in nasa1mucosa.CONCLUSION Kaempfero1 has significant protective effect against ova1bumin-induced a11ergic rhinitis in guinea pigs.

KEY WORDS：kaempfero1；ova1bumin；a11ergic rhinitis

*通信作者：黃家君（1964—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為抗腫瘤藥理與抗炎免疫藥理。Te1：（023）68485161，E-mai1：huangjiajuncqmu@163.com

作者簡介：周運江（1990—），男，碩士生，研究方向為抗腫瘤藥理與抗炎免疫藥理。Te1：18223173440，E-mai1：zyjcqmu@163.com

基金項目：重慶市科委自然科學(xué)基金（CSTC，2010BB5111）；重慶市教委自然科學(xué)基金（KJ100308）

收稿日期：2015-02-01

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.005

中圖分類號：R966

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0024-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-08-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150811.1211.002.htm1