徐麒麟,何　琿,馬　容,陳咨余,易治鑫,康　波,姜冬梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室,四川 成都　611130)

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四川白鵝Calm1結(jié)構(gòu)特征及其差異表達的研究

徐麒麟,何琿,馬容,陳咨余,易治鑫,康波,姜冬梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室,四川 成都611130)

摘要：為闡明鵝Calm1基因結(jié)構(gòu)特征及其表達規(guī)律?？寺∷拇ò座ZCalm1基因編碼區(qū)序列并進行生物信息學(xué)分析,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測鵝不同等級卵泡和不同組織中Calm1基因的相對表達量。鵝Calm1基因編碼區(qū)序列全長為450 bp,編碼149個氨基酸,其氨基酸序列與原雞相似性為99%。鵝大腦中Calm1表達量顯著高于其他組織(P<0.05)。Calm1在不同等級卵泡組織中均有表達,F2級卵泡中Calm1表達量是小白卵泡(Small white follicles,SWF)的1.76倍(P<0.05),且顯著高于F5、F4、F3和F1級卵泡(P<0.05);在排卵后卵泡(Postovulatory follicle,POF)組織中,POF1級卵泡組織中Calm1表達量顯著高于POF2、POF3和POF4級卵泡(P<0.05)；卵巢組織中Calm1的表達量，是小白卵泡的1.75倍(P<0.05)。Calm1是高度保守、廣泛表達的蛋白質(zhì),Calm1可能通過影響卵泡細胞增殖和類固醇激素合成來參與調(diào)控動物繁殖。

關(guān)鍵詞：四川白鵝;實時熒光定量PCR;Calm1;基因表達

鈣調(diào)蛋白是真核生物細胞廣泛存在、高度保守的鈣離子結(jié)合蛋白[1],鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合,并且活化下游鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶或磷酸化酶,進而參與調(diào)控細胞生長、增殖及代謝過程[2]。鈣調(diào)蛋白是心肌細胞鈣離子通道重要的調(diào)節(jié)因子，能夠與ATP相互作用進而參與調(diào)控機體的生命活動[3]。脊椎動物卵母細胞的減數(shù)分裂和受精過程受到多種蛋白激酶的調(diào)節(jié),鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ參與了卵母細胞成熟[4]。卵母細胞成熟過程是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程[5]。王晨光等[6]研究發(fā)現(xiàn),鈣調(diào)蛋白參與了MⅠ期卵母細胞向MⅡ期發(fā)育的過程,并且可能與細胞內(nèi)鈣離子的核周區(qū)分布有關(guān)。此外,鈣調(diào)蛋白與鈣離子結(jié)合促進了母雞卵泡膜細胞類固醇激素的分泌,同時抑制了雄烯二酮的產(chǎn)生[7]。

哺乳動物的Calm基因包含3個亞型(Calm1、Calm2和Calm3)[8]。Calm1可參與調(diào)節(jié)細胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放[9]。Calm1是雞卵泡膜細胞雄激素產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)因子,對類固醇激素分泌具有促進作用[10],Calm1可以激活禽殼腺部鈣離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進而促進蛋殼的形成[11]，此外,Calm1還能促進精子活化及運動[12]?？挡ǖ萚13]研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)蛋期鵝卵巢組織中Calm1表達量顯著高于產(chǎn)蛋前期,提示其可能參與鵝卵巢功能的調(diào)節(jié)。然而,目前關(guān)于禽類Calm1的結(jié)構(gòu)特征及表達規(guī)律尚未見相關(guān)報道。因此,本研究克隆四川白鵝Calm1基因編碼區(qū)序列,并利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析Calm1基因及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能;同時采用熒光定量PCR技術(shù)研究Calm1在四川白鵝不同卵泡和組織中的表達規(guī)律,為進一步研究Calm1調(diào)控動物繁殖功能奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗動物及樣品采集

選取健康、產(chǎn)蛋高峰期的四川白鵝5只(由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場提供),采集小白卵泡(Small white follicles,SWF)、小黃卵泡(Small yellow follicles,SYF)、F5、F4、F3、F2、F1、排卵后卵泡(Postovulatory follicle,POF)(依次為POF1、POF2、POF3和POF4)和心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸肌、腿肌、大腦、小腦、松果體、下丘腦、垂體、視網(wǎng)膜、脊髓、輸卵管及卵巢組織,液氮冷凍后,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫原雞Calm1和β-actin基因序列,采用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計引物并委托寶生物(大連)有限公司合成。擴增Calm1基因CDS區(qū)的上游引物為5′-CCAGCCCAAACAGTG TAATAGT-3′,下游引物為5′-CATGGCTGACCAGCT GACCGAA-3′(PCR產(chǎn)物Calm1-L大小為746 bp)。Calm1熒光定量引物上游為5′-ATGAGGTCGTTG GGTCAAAATC-3′,下游為5′-CCTTGTCAAAGACTC GGAATGC-3′(PCR產(chǎn)物Calm1-S大小為178 bp);β-actin基因上游引物為5′-GCGGCATGCCACACCG TGCCCATCTATGAG-3′,下游引物為5′-GCGAAGCT TGGCCATCTCCTGCTCGAAGT-3′(PCR產(chǎn)物β-actin大小為222 bp)。

1.3組織總RNA提取與cDNA模板制備

按照TRIzol試劑操作說明書提取所采集的組織總RNA,分別取3.0 μL總RNA于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板,首先去除基因組DNA,反應(yīng)體系為10 μL,包括1.0 μL總RNA,2.0 μL 5 XgDNA Eraser Buffer,1.0 μL gDNA Eraser，6.0 μL RNase Free H2O。反應(yīng)條件為:42 ℃ 2 min和4 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL,包括10 μL去除基因組DNA的反應(yīng)液,4 μL 5 XPrimeScript? BufferⅡ,1.0 μL PrimeScript? RT Enzyme MixⅠ,1.0 μL RT Primer Mix和4.0 μL RNase Free H2O。反應(yīng)條件為:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s和4 ℃ 5 min,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Calm1基因克隆

將20 μL的Premix TaqTM(2×),各1 μL(10 μmol/L)的Calm1上、下游引物,2.0 μL的組織cDNA模板以及16 μL的無RNase水加入PCR反應(yīng)管中。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,選取陽性PCR產(chǎn)物,瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因片段,將回收產(chǎn)物連接至pMD-19T載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,菌液PCR鑒定后,挑選3個陽性克隆委托寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.5Calm1基因生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對Calm1編碼區(qū)序列和氨基酸序列相似性;利用Protparam在線軟件預(yù)測Calm1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam/);應(yīng)用在線軟件PSORT II Prediction分析Calm1的亞細胞定位(http://psort.hgc.jp/form2.html);ProtScale軟件分析氨基酸疏水性(http://web.expasy.org/protscale/);NetPhos2.0分析Calm1的磷酸化位點(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/);NetNGlyc 1.0 Server分析Calm1的N-糖基化位點(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/);利用SOPMA軟件預(yù)測Calm1二級結(jié)構(gòu)(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html);利用SWISS-MODEL對Calm1蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://www.swissmodel.expasy.org/);利用MotifScan軟件(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析Calm1蛋白質(zhì)的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域。

1.6實時熒光定量PCR

用β-actin作為內(nèi)參基因,定量檢測所采集樣品組織中Calm1基因的表達量,每個樣品3個重復(fù),反應(yīng)體系為10 μL:SYBR Green 5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,cDNA模板0.5 μL,RNase Free H2O 4.1 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,61.6 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s(采集熒光),39個循環(huán);95 ℃ 10 s,然后以0.5 ℃/10 s的速率從65 ℃緩慢升溫至95 ℃繪制溶解曲線。

1.7統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù),以小白卵泡和心臟中Calm1基因的表達量分別設(shè)為1,計算四川白鵝不同等級卵泡和組織中Calm1基因的相對表達量。應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計分析軟件中的MEANS過程進行描述性統(tǒng)計分析,ANOVA過程進行方差分析和Duncan多重比較,P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1Calm1基因克隆

如圖1-A所示,所提取的總RNA樣品經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),樣品RNA具有清晰完整的28S、18S條帶,表明RNA未降解,可用于后續(xù)的克隆及熒光定量,利用特異性引物,以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,對Calm1基因和β-actin基因進行擴增,經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,分別獲得了與預(yù)期大小一致的746,178,222 bp的特異目的條帶(圖1-B)。

圖1　總RNA提取及Calm1、β-actin基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2Calm1基因生物信息學(xué)分析

四川白鵝Calm1基因全長450 bp,編碼149個氨基酸;Calm1蛋白質(zhì)分子量為16.811 5 kDa,理論pI值4.06,分子式為C718H1127N187O257S10;不穩(wěn)定系數(shù)為27.20。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明,Calm1主要分布于細胞質(zhì)(52.2%)、細胞核(21.7%)、線粒體(13.0%)、液泡(4.3%)、細胞骨架(4.3%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.3%)。Calm1氨基酸序列中第70位氨基酸殘基具有最高分值(1.022),疏水性最強;第79位具有最低分值(-2.489),親水性最強(圖2)?？傮w而言,親水性區(qū)域明顯大于疏水性區(qū)域,Calm1屬于親水性蛋白質(zhì)。

圖2　Calm1親水性/疏水性分析

磷酸化位點預(yù)測結(jié)果表明,Calm1中含有7個磷酸化位點,其中Ser(絲氨酸,Serine,S)位點有3個(18、82和102),Thr(蘇氨酸,Threonine,T)有3個(29、80、和118),Tyr(酪氨酸)有1個(100),糖基化位點預(yù)測結(jié)果表明，N-糖基化位點有2個(43和61)。通過SOPMA軟件預(yù)測Calm1基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,Calm1氨基酸α-螺旋占62.42%,延伸鏈占7.38%,β-轉(zhuǎn)角占9.4%,無規(guī)則卷曲占20.81%;利用SWISS-MODEL在線軟件進行同源建模(圖3)，得到四川白鵝Calm1蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型與小鼠的Calm1三級結(jié)構(gòu)(3wfn.1.A)類似,該蛋白與數(shù)據(jù)庫中提供的模板具有100%同源性。

圖3　Calm1三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3Calm1序列比對分析

四川白鵝Calm1氨基酸序列與原雞(NP_001103834.1)序列的相似性為99%,與綠頭鴨(XP_005031791.1)、人(NP_008819.1)、小鼠(NP_033920.1)和非洲爪蟾(NP_001089059.1)序列相似性均為100%。如圖4所示,四川白鵝存在4個EF-hand鈣離子結(jié)構(gòu)域和4個EF-hand結(jié)構(gòu)域,除了原雞的Calm1第97位氨基酸為絲氨酸(其余均為甘氨酸),其他物種的Calm1結(jié)構(gòu)域均高度保守。

….EF-hand 鈣離子結(jié)構(gòu)域;─.EF-hand結(jié)構(gòu)域。

2.4Calm1基因在不同組織中的相對表達量

如圖5所示,在所檢測的17個四川白鵝組織中,大腦組織中Calm1表達量最高,是心臟的10.97倍(P<0.05);在輸卵管、脊髓、小腦、肺臟、下丘腦、垂體中,Calm1的表達量也相對較高,分別是心臟的3.55,3.31,2.97,2.88,2.47,2.11倍(P<0.05),肝臟、腎臟、胸肌、腿肌、脾臟、腎上腺、松果體、視網(wǎng)膜、卵巢中Calm1的表達量與心臟組織相比差異不顯著(P>0.05)。

H.心臟;L.肝臟;S.脾臟;Lu.肺臟;K.腎臟;AG.腎上腺;BM.胸肌;TM.腿肌;C.大腦;Ce.小腦;PG.松果體;Hy.下丘腦;

2.5Calm1基因在不同卵泡組織中的相對表達量

如圖6所示,Calm1在所檢測的卵泡組織中均有表達,F2級卵泡中Calm1表達量最高(P<0.05),是SWF的1.76倍且顯著高于F5、F4、F3和F1卵泡(P<0.05)。F1卵泡顯著高于F5卵泡(P<0.05),但與F4和F3卵泡差異不顯著(P>0.05)。在排卵后卵泡中,POF1級卵泡的Calm1表達量最高,是SWF的1.90倍(P<0.05),POF2、POF3和POF4中Calm1的表達量差異不顯著(P>0.05)。卵巢組織中Calm1的表達量是SWF的1.75倍且顯著高于等級前卵泡(P<0.05)。

圖6　四川白鵝不同等級卵泡中Calm1基因的相對表達量

3討論與結(jié)論

在不同物種之間,鈣調(diào)蛋白氨基酸一級結(jié)構(gòu)非常保守[14]。封瑞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠Calm2編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列與其他種屬完全一致。四川白鵝Calm1氨基酸序列的C-末端比綠頭鴨少了3個非極性氨基酸(Phe-Phe-Val),提示這3個氨基酸殘基對鵝Calm1功能的影響較小。此外,原雞Calm1第97位氨基酸為絲氨酸,而四川白鵝為甘氨酸,2個氨基酸均為非極性疏水氨基酸,屬于保守性突變。四川白鵝Calm1具有7個磷酸化位點和2個N-糖基化位點,表明其具有豐富的轉(zhuǎn)錄以及翻譯后修飾過程[16]。鈣調(diào)蛋白屬于EF-Hand家族鈣離子結(jié)合蛋白,包含了進化上保守的4個EF-Hand鈣離子結(jié)構(gòu)域[17]。本研究表明,四川白鵝Calm1氨基酸的4個EF-Hand鈣離子結(jié)構(gòu)域與其他物種高度保守,提示不同物種鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子的機制可能較為相似[18]。

Calm1參與調(diào)控基因的表達、蛋白質(zhì)合成、細胞的分裂和增殖等生物學(xué)過程[19]。大腦是動物機體的重要生命中樞,其種類豐富的神經(jīng)元中也表達Calm1[20]。人大腦和骨骼肌組織中Calm1表達量顯著高于心臟、胎盤、肺、肝、腎和胰腺組織[20],而且雞大腦組織中Calm1豐富表達[21]。本研究發(fā)現(xiàn)四川白鵝大腦組織中Calm1表達量也顯著高于其他組織,說明Calm1在維持大腦正常功能中具有重要作用。文昌魚Calm1在卵巢組織中的表達量顯著高于鰓、肌肉、脊索、睪丸和腸組織[14],爪蟾的卵巢和睪丸組織中Calm1的表達量也很高[22]。然而,本研究發(fā)現(xiàn)四川白鵝卵巢組織中Calm1表達量與胸肌和腿肌無顯著差異,提示在不同物種之間Calm1組織分布存在一定差異。

Matsuura等[23]研究表明,Calm1能夠調(diào)節(jié)小鼠卵泡的發(fā)育和排卵。在本研究中表明,四川白鵝Calm1在不同卵泡組織中均有表達,等級卵泡組織中Calm1的表達量逐漸升高且在F2級卵泡中達到最高值;在排卵后卵泡中,POF1級卵泡的Calm1的表達量最高,POF2、POF3和POF4中Calm1的表達量差異不顯著,而且卵巢組織中Calm1表達量也相對較高。鄭亦輝等[24]研究發(fā)現(xiàn),湖羊和美利奴羊隨著卵泡的發(fā)育和直徑的增大,Calm1的水平也相應(yīng)地增加,二者呈現(xiàn)較強的正相關(guān),這與鵝Calm1在不同等級卵泡的表達趨勢相似。卵泡組織發(fā)育伴隨著大量細胞的增殖、凋亡過程,而Calm1在細胞增殖和凋亡過程中具有重要調(diào)控作用[19],說明Calm1可能通過影響卵泡細胞的增殖進而影響卵泡的發(fā)育。膽固醇是卵泡類固醇激素生成的重要底物[25],cAMP和Ca2+是調(diào)控類固醇激素生成的第二信使[26],卵泡發(fā)育和成熟均受類固醇激素的調(diào)節(jié)。Calm1不僅可通過介導(dǎo)cAMP合成進而影響類固醇激素生成[27],而且還可通過促進顆粒細胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運和利用來參與調(diào)控卵巢顆粒細胞類固醇激素生成[28]。此外，Calm1可以與鈣離子結(jié)合并調(diào)節(jié)顆粒細胞類固醇激素的表達[29]。本研究發(fā)現(xiàn)鵝POF1級卵泡中Calm1的表達量顯著高于F1級卵泡,推測Calm1可能通過影響類固醇激素的合成進而影響卵泡的成熟及排卵。

本研究克隆并獲得了450 bp的四川白鵝Calm1基因完整編碼區(qū)序列,編碼了149個氨基酸殘基,不同物種之間Calm1氨基酸序列高度保守。Calm1在不同組織中均有表達,大腦組織中Calm1表達量最高。鵝Calm1在圍排卵期卵泡組織中的表達量顯著高于其他卵泡組織,說明Calm1在鵝卵泡成熟和排卵過程具有重要調(diào)控作用。然而,其機制仍有待于進一步研究。

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Characterization and Differential Expression Profile ofCalm1 Gene in Sichuan White Goose

XU Qilin,HE Hui,MA Rong,CHEN Ziyu,YI Zhixin,KANG Bo,JIANG Dongmei

(College of Animal Science and Technology,Sichuan Agricultural University,Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu611130,China)

Abstract：In order to elucidate the characteristics and expression profile of Calm1 in ovarian hierarchical follicles and tissues of Sichuan white goose,the Calm1 coding region sequence of the goose was clone,and it′s structure and function was characterized.The relative abundance of Calm1 mRNA in ovarian follicles and various tissues of Sichuan white goose were assessed by quantitative Real-time PCR.The results showed that the Calm1 coding sequence was 450 bp with encoding 149 amino acid residues.The sequence of the goose Calm1 amino acids shared a 99% similarity compared to Gallus gallus.The level of Calm1 gene expression in cerebrum was significantly higher than others (P<0.05).Calm1 transcripts were detectable in all of the experimental follicles.The level of Calm1 gene expression in F2 was 1.76-fold compared with small white follicles,and was significantly higher than F5，F(xiàn)4，F(xiàn)3 and F1 level follicle (P<0.05).The level of Calm1 in postovulatory follicle 1 was significantly higher than POF2，POF3 and POF4 (P<0.05).The Calm1 expression level in ovarian tissue was 1.75-fold compared with small white follicles (P<0.05).Calm1 is a highly conserved ubiquitous protein.Calm1 may participate in regulating the animal reproduction by affecting the growth of follicular cell proliferation and synthesis of steroid hormones.

Key words:Sichuan white goose;Quantitative Real-time PCR; Calm1;Gene expression

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.021

中圖分類號：S858.03

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0128-06

作者簡介：徐麒麟(1992-),男,四川崇州人,在讀碩士,主要從事動物卵泡發(fā)育機理研究。通訊作者：姜冬梅(1978-),女,黑龍江海林人,實驗師,碩士,主要從事動物生產(chǎn)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31201798);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20105103120003)

收稿日期：2015-09-10

康波(1978-),男,黑龍江林口人,副教授,博士,主要從事動物生理與環(huán)境生理、家禽遺傳育種與繁殖研究。