張寶娜,朱燦燦,張鵬鈺,衛(wèi)　麗,王　翔,姜玉梅,王同朝

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 鄭州　450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家小麥工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州　450002)

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普通小麥春化基因VRN1 RNA干擾載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小麥獲得

張寶娜1,朱燦燦2,張鵬鈺1,衛(wèi)麗2,王翔2,姜玉梅2,王同朝1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家小麥工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州450002)

摘要：為進一步探究春化基因VRN1在小麥發(fā)育進程中的功能,利用熒光定量PCR分析了VRN1基因在不同發(fā)育特性小麥品種新春2號、京841中的表達情況。結(jié)果表明,隨著生育進程的推進,VRN1基因在新春2號葉片和莖尖中表達量均呈上升趨勢,VRN1基因在京841葉片中呈波動上升趨勢,在莖尖中表達量趨于0;以pFGC5941載體為基礎(chǔ)構(gòu)建含有VRN1反向重復(fù)序列的 RNA干擾載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化新春2號獲得了再生植株,并通過PCR法檢測獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株,為從分子水平上實現(xiàn)小麥發(fā)育特性遺傳改良和創(chuàng)育小麥新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥;春化基因VRN1;表達;轉(zhuǎn)化

小麥春化作用是一個高度復(fù)雜的生理生化過程,也是小麥(TriticumaestivumL.)生長發(fā)育進程中的一個重要階段,受多基因調(diào)控。小麥春化作用主要受VRN1、VRN2、VRN3、VRN4等基因調(diào)控[1-3]。普通小麥VRN1基因有3個同源基因,VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1[4-7]。3個同源基因中任何一個基因的調(diào)控區(qū)發(fā)生插入、缺失,就能使VRN1基因變?yōu)轱@性,導(dǎo)致小麥發(fā)育特性表現(xiàn)為春性即不需要經(jīng)過春化作用就能抽穗開花[8-9]。前人研究表明,VRN1是小麥春化作用所必需的關(guān)鍵基因[1,10-11]。VRN1基因編碼一種MADS-box轉(zhuǎn)錄因子,其可與靶基因啟動子區(qū)中的CArG-box特異結(jié)合,該轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥分生組織鑒定基因AP1/FRUITFUL的同源基因;MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是重要的溫度響應(yīng)基因,調(diào)控小麥由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的發(fā)育進程[12-13]。小麥中VRN1基因受低溫誘導(dǎo)表達,隨著春化時間的延長,VRN1的表達量逐漸增加,直到達到開花所需的量后,才能使植株由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長[14]。可見VRN1對春化作用的響應(yīng)是具有一定閾值的。袁秀云等[15]對國內(nèi)不同春化發(fā)育特性小麥品種VRN1的基因組成進行分析發(fā)現(xiàn),小麥品種的VRN1基因顯隱性組成與該品種的春化發(fā)育特性基本符合,說明VRN1的顯隱性組成是決定小麥發(fā)育特性的主要內(nèi)在因素。不同生態(tài)種植區(qū)小麥VRN1的3個等位基因分布比率及組合也不同,這一差異體現(xiàn)了植物適應(yīng)性的多樣性[16-18]。為進一步探究春化基因VRN1在小麥發(fā)育進程中的功能,本試驗以不同發(fā)育特性小麥品種新春2號和京841為材料,分析了VRN1的表達水平,并構(gòu)建了VRN1 RNA干擾載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥莖尖轉(zhuǎn)化法進行遺傳轉(zhuǎn)化,以期深入探討VRN1基因在小麥春化階段的功能,為從分子水平上實現(xiàn)小麥春化特性遺傳改良提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

春性小麥品種為新春2號,冬性小麥品種為京841。大腸桿菌菌株(Escherichiacoli)為DH5α,克隆載體為pMD19-T,均購自TaKaRa生物公司。農(nóng)桿菌菌株為EHA105,植物表達載體為pFGC5941載體,均由國家小麥工程技術(shù)研究中心保存擴繁。TRIzol等其他試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2小麥培養(yǎng)及取樣

分別選取新春2號和京841成熟飽滿大小均一的種子,置于培養(yǎng)皿中,放置于溫度為24 ℃的培養(yǎng)箱中。萌動后種植到直徑為30 cm的花盆中(花盆中的營養(yǎng)土∶草炭∶蛭石為3∶2∶1),放置在人工氣候室中(溫度為(22±2)℃,光周期為16 h光照/8 h黑暗)。當2個小麥品種大部分幼苗都處于3葉期(在人工氣候室生長3周)時開始取樣,并觀察幼穗分化進程。每周取一次樣,取倒數(shù)第二葉,春性品種取樣直到小麥穗發(fā)育完成(羽毛形成期),冬性品種取樣到試驗結(jié)束為止。每次取樣時間均為光照開始后1～2 h,以盡可能避免基因節(jié)律表達對表達分析結(jié)果的影響。所有樣品用液氮速凍后,置于-80 ℃超低溫冰箱保存用于RNA提取。

1.3試驗方法

1.3.1RNA的提取采用TRIzol試劑提取材料的總RNA。

1.3.2熒光定量PCR(qRT-PCR)分析以各時期所取新春2號和京841的RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板,采用引物VRN1-F、VRN1-R及WAC-F、WAC-R(表1)對VRN1和β-Actin(內(nèi)參基因)基因進行qRT-PCR擴增。PCR反應(yīng)系為20 μL,反應(yīng)程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s。反應(yīng)在Bio-red CFX96 熒光定量PCR儀上運行,采用2-ΔΔCt方法進行定量分析,每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

表1　qRT-PCR分析引物

1.3.3VRN1 RNA干擾表達載體的構(gòu)建用引物對RiV1-F1/RiV1-R1和RiV1-F2/RiV1-R2(表2)擴增出VRN1的cDNA部分正、反向片段,連入pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后挑選白色菌斑于37 ℃搖菌,提取質(zhì)粒。先用NcoⅠ/SwaⅠ酶切帶有正向片段的pMD19-T載體和pFGC5941載體,然后將酶切得到的正向目的片段與酶切后pFGC5941載體的大片段連接,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,挑取白色菌斑于37 ℃搖菌,提取質(zhì)粒酶切檢測,選取正確的陽性克隆進一步進行測序驗證。然后用BamHⅠ/SmaⅠ酶切帶有反向片段的pMD19-T載體以及已插入正向目的片段的重組pFGC5941載體,并將切下的反向目的片段與已插入正向目的片段的重組pFGC5941載體酶切后的大片段連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,挑取白色菌斑于37 ℃搖菌,提取質(zhì)粒酶切檢測,選取正確的陽性克隆進一步測序驗證。

表2　VRN1 RNA干擾表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因后代檢測引物

注：下劃線處為酶切位點。

Note:The underline part is the enzyme site.

1.3.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得選取飽滿的新春2號種子進行滅菌,用70%的乙醇浸泡2 min,再用0.1% HgCl2浸泡5 min,無菌水沖洗3～5次。滅菌種子擺放在培養(yǎng)皿中,加適量無菌水在黑暗條件下萌發(fā)。同時將構(gòu)建好的VRN1 RNA干擾表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,挑取單克隆,將經(jīng)PCR檢測及重組質(zhì)粒酶切驗證為陽性的單克隆擴搖,當菌液OD600為1.0時即可用于侵染小麥幼苗莖尖。待小麥幼苗長至2～4 cm時,用滅菌后的手術(shù)刀片沿胚根向胚芽鞘伸長方向向下切斷維管束,然后水平方向切去胚芽及胚的上半部分,暴露或損傷生長點部位,將幼苗置于含有VRN1 RNA干擾表達載體的農(nóng)桿菌菌液中浸泡幾分鐘。用無菌濾紙吸干種子表面的菌液轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中,黑暗條件下共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中,直至重新長出新葉,在人工氣候室培養(yǎng)至成熟。

1.3.5轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測根據(jù)BAR基因設(shè)計一對特異引物BAR-F/BAR-R(表2)對轉(zhuǎn)基因后代進行分子檢測。經(jīng)過BAR基因檢測為陽性的植株,為鑒定其是否含有插入目的基因,以T1植株DNA為模板,設(shè)計跨目的基因和載體序列的特異性引物VRN1-F3/VRN1-R3(表2),對T1轉(zhuǎn)基因小麥植株進行PCR檢測。

2結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)育特性小麥品種中VRN1基因的表達水平

從圖1可以看出,從三葉期取樣開始到取樣第5周,新春2號葉片和莖尖中VRN1基因表達量均呈上升趨勢;從取樣開始到取樣第3周,VRN1在莖尖中的表達量低于其在葉片中的表達量,但從取樣第4周開始VRN1在莖尖中的表達量超過了葉片,在取樣第5周達到最大值,此時新春2號穗發(fā)育完成(羽毛形成期)。對于冬性小麥品種京841,葉片中VRN1的表達量總體呈波動上升趨勢;在莖尖中的表達量很低,接近0,雖然取樣第8，10周葉片中VRN1基因表達量升高,但依然達不到小麥開花所要求的閥值,其幼穗分化一直處于單棱期,說明在未春化條件下,京841不能正常進行穗分化。

圖1　VRN1在新春2號和京841中的表達分析

2.2VRN1 RNA干擾載體的構(gòu)建

用2對引物RiV1-F1/RiV1-R1和RiV1-F2/RiV1-R2分別擴增得到了VRN1 cDNA的部分正(V1-1)、反(V1-2)向片段,大小均為349 bp(圖2-A)。連入pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒。用NcoⅠ/SwaⅠ酶切帶有V1-1的pMD19-T載體和pFGC5941載體(圖2-B)。然后將酶切得到的V1-1與酶切后pFGC5941載體的大片段連接。用BamHⅠ/SmaⅠ酶切帶有V1-2片段的pMD19-T載體以及已插入V1-1片段的重組pFGC5941載體(圖2-C),并將切下的V1-2片段與重組pFGC5941載體酶切后的大片段連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選陽性克隆提取質(zhì)粒,并對獲得的重組質(zhì)粒進行酶切驗證(圖2-D),進一步經(jīng)測序比較發(fā)現(xiàn)序列完全正確。A.VRN1干擾片段的PCR擴增:M.DL2000 DNA Marker;1~2.擴增的V1-1片段;3~4.擴增的V1-2片段;B.含有V1-1片段的T載體和pFGC5941載體的NcoⅠ和SwaⅠ雙酶切:M.DL2000 DNA Marker;1~3.含有V1-1片段的pMD19-T載體和pFGC5941載體經(jīng)NcoⅠ和SwaⅠ酶切后的片段;2.DL10000 DNA Marker;C.含有V1-2片段的T載體和含有V1-1片段的pFGC5941載體的BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切:M.DL10000 DNA Marker;1.V1-1和pFGC5941的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ酶切后的片段;2.pFGC5941和V1-1的重組質(zhì)粒;3.含有V1-2片段的T載體經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ酶切的片段;D.VRN1 RNA干擾載體的酶切驗證:1.V1-1、V1-2和pFGC5941的重組質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和SwaⅠ酶切的片段；2.V1-1、V1-2和pFGC5941的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ酶切的片段。

A.VRN1 RNAi gene fragment cloning:M.DL2000 DNA Marker;1-2.V1-1 gene fragment cloning;3-4.V1-2 gene fragment cloning;B.Enzyme digestion of recombined vector pMD19-T and V1-1,pFGC5941 byNcoⅠ andSwaⅠ:M.DL2000 DNA Marker;1,3.Enzyme digestion of recombined vector pMD19-T and V1-1,pFGC5941 byNcoⅠ andSwaⅠ;2.DL10000 DNA Marker;C.Enzyme digestion of recombined vector pMD19-T and V1-2,pFGC5941 and V1-1 byBamH Ⅰ andSmaⅠ:M.DL10000 DNA Marker;1.Enzyme digestion of recombined vector V1-1 and pFGC5941 byBamH Ⅰ andSmaⅠ;2.Recombined vector pFGC5941 and V1-1;3.Enzyme digestion of recombined vector pMD19-T and V1-2 byBamH Ⅰ andSmaⅠ;D.Double digestion of recombined vector:1.Enzyme digestion of recombined vector V1-1,V1-2 and pFGC5941 byNcoⅠ andSwaⅠ;2.Enzyme digestion of recombined vector V1-1,V1-2 and pFGC5941 byBamH Ⅰ andSmaⅠ.

圖2VRN1 RNA干擾載體的構(gòu)建

Fig.2The construction ofVRN1 RNAi vector

2.3轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測

轉(zhuǎn)基因小麥T0成熟時,單株收獲種子。將T1種子栽于人工氣候室,待T1長至兩葉一心時,噴草銨膦進行篩選。經(jīng)除草劑篩選后的綠色植株,在生長至五葉期提取葉片DNA。根據(jù)BAR基因序列引物,以非轉(zhuǎn)基因新春2號DNA為陰性對照,構(gòu)建的RNA干擾表達載體質(zhì)粒為陽性對照,對T1小麥DNA進行PCR檢測。由圖3可知,轉(zhuǎn)基因陽性植株和陽性對照均擴增出428 bp的目的條帶,而未轉(zhuǎn)化成功的植株和陰性對照均未擴增出該目的條帶。

M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照;2.陰性對照;3~12.T1轉(zhuǎn)基因植株。

根據(jù)跨目的基因和載體序列的特異引物VRN1-F3/VRN1-R3,以構(gòu)建好的RNA干擾表達載體質(zhì)粒為陽性對照,pFGC5941質(zhì)粒為陰性對照,進行PCR擴增。由圖4可知,經(jīng)BAR基因PCR鑒定為陽性的T1植株,多數(shù)都能檢測到與陽性對照大小一致的條帶即401 bp的目的條帶,而陰性對照未擴增出目標片段,說明部分轉(zhuǎn)基因T0植株在后代遺傳過程中出現(xiàn)導(dǎo)入基因丟失的情況。由圖4可知,T1轉(zhuǎn)基因植株中有5株為轉(zhuǎn)基因陽性植株,說明外源基因已轉(zhuǎn)移整合至小麥染色體基因中。

3結(jié)論與討論

春化是小麥發(fā)育進程中一個至關(guān)重要的階段。Preston等[19]提出,VRN1在開花調(diào)控中分飾不同的角色,春化過程中VRN1在葉片中上調(diào)表達能夠促進植株開花。據(jù)此可知,葉片中VRN1能夠感受低溫處理,使植株開花,并且當植株移到溫暖的環(huán)境中時,VRN1在莖尖分生組織中表達量升高,誘導(dǎo)花序發(fā)生,同時VRN1在葉片中的表達量下降至春化前的水平。但葉片中VRN1會快速回升并在葉片中保持一定的表達量,以此來阻止VRN2在溫暖長日照條件下表達對開花的抑制[19]。本試驗分析了VRN1在葉片和莖尖中的表達,發(fā)現(xiàn)VRN1在春性小麥品種新春2號葉片和莖尖中的表達量隨著生長發(fā)育的推進均呈上升趨勢,而且在觀察階段后期在莖尖中的表達量超過了在葉片中的表達量。而在冬性小麥品種京841葉片中的表達量總體呈波動上升的趨勢,但在莖尖中的表達量很低,說明VRN1在葉片和莖尖中的表達不同步。京841即使在取樣第8周和第10周葉片中VRN1稍高的表達量條件下花序并未形成,說明不經(jīng)過低溫春化處理的冬性小麥莖尖中VRN1持續(xù)低表達,不能誘導(dǎo)小麥穗發(fā)育。

M.DL2000 DNA Marker;1~21.轉(zhuǎn)化小麥T1 DNA;22.陽性對照;23~24.陰性對照。

通過傳統(tǒng)雜交來改良小麥冬春性,不可避免地會遇到父母本之間花期不遇等問題。而通過構(gòu)建植物表達載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株,不僅能有效地從分子水平對小麥春化特性進行特異性遺傳改良,還為進一步研究基因功能和選育品種提供基礎(chǔ)材料[20]。本試驗采用小麥幼苗的莖尖分生組織作為轉(zhuǎn)化受體,莖尖分生組織在農(nóng)桿菌侵染后很容易再生出植株,不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)和植株再生,有效地克服了組織培養(yǎng)過程中基因型障礙造成的難以獲得再生植株的缺點,擴大了小麥轉(zhuǎn)化的基因型范圍,可根據(jù)試驗需要選用不同冬春性的品種進行遺傳轉(zhuǎn)化[21-23]。與以幼胚及其胚性愈傷組織為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化相比,此方法還具有試驗周期短、取材不受季節(jié)限制等優(yōu)點。但再生植株是嵌合體,在后代遺傳過程中導(dǎo)入的基因可能會丟失,因此，在后續(xù)試驗中的工作重點是要篩選出遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株系,觀察轉(zhuǎn)基因材料的發(fā)育特性以及農(nóng)藝性狀,期待篩選出適合黃淮海麥區(qū)種植的優(yōu)異小麥新種質(zhì)。

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RNA Interference Vector Construction ofVRN1 Gene and Obtaining Transgenic Wheat

ZHANG Baona1,ZHU Cancan2,ZHANG Pengyu1,WEI Li2,WANG Xiang2,JIANG Yumei2,WANG Tongchao1

(1.Agronomy College of Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China;2.National Engineering Research Centre for Wheat,Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China)

Abstract：In order to study the biological function of VRN1 in wheat developmental process,VRN1 expression patterns were analyzed using fluorescence quantitative RT-PCR in two vernalization characteristic varieties Xinchun No.2 and Jing 841.The results showed that the VRN1 transcription levels increased gradually in Xinchun No.2 leaves and shoot meristems.While the VRN1 transcription levels in Jing 841 leaves showed a wavelike rises,but the expression level in shoot meristems was very low and nearly zero.The VRN1 RNA interference sequence was successfully introduced into vector pFGC5941,and the recombined vector was transferred into the shoot apical meristem of Xinchun No.2 by Agrobacterium-mediated transformation.Transgenic plants were detected by PCR amplification,which could lay a foundation for genetic improvement of wheat developmental characteristics on molecular level and created new wheat germplasm for wheat breeding.

Key words:Wheat;Vernaliazation gene VRN1;Expression;Transformation

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.010

中圖分類號：S512.03;Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0057-06

作者簡介：張寶娜(1988-),女,河南杞縣人,在讀碩士,主要從事小麥發(fā)育研究。通訊作者：王同朝(1964-),男,河南社旗人,教授,博士,主要從事作物生理生態(tài)研究。

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD14B08；2012BAD04B07);國家自然科學(xué)基金項目(31471452)

收稿日期：2015-11-19