王彬彬　張翠萍　趙志力　付小兵（.北京軍區(qū)總醫(yī)院激光整形外科中心，北京 00700；.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 00048）

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晚期糖化終產(chǎn)物產(chǎn)生的皮膚自發(fā)熒光對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥診斷的重要意義

王彬彬1張翠萍2趙志力2付小兵2
（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院激光整形外科中心，北京 100700；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

晚 期糖 化終 產(chǎn) 物(advanced glycosylation end products, AGEs)是糖和蛋白質(zhì)之間非酶反應(yīng)的產(chǎn)物。近年來(lái)的研究表明，AGEs水平與糖尿病及其并發(fā)癥有著一定的相關(guān)性。AGEs可以產(chǎn)生熒光，通過(guò)測(cè)量皮膚自發(fā)熒光強(qiáng)度可以了解AGEs的積聚量，從而判斷疾病進(jìn)程。由于皮膚自發(fā)熒光的測(cè)量具有無(wú)創(chuàng)性和穩(wěn)定反映AGEs水平的特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為檢測(cè)AGEs的重要手段。

1　AGEs的形成及其作用機(jī)制

1.1AGEs的形成AGEs是糖和蛋白質(zhì)非酶反應(yīng)的終產(chǎn)物。1912年法國(guó)科學(xué)家Millard首次發(fā)現(xiàn)AGEs的形成過(guò)程，后為紀(jì)念這位科學(xué)家稱(chēng)此反應(yīng)為美拉德反應(yīng)（Millard reaction）。其形成過(guò)程是糖、脂肪中的羰基和蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的游離氨基之間發(fā)生反應(yīng),生成“席夫堿（Schiff base）”[1]，然后通過(guò)結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)的重組,形成更穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物，Amadori產(chǎn)物通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)性變化（包括氧化、脫水和降解）最終形成穩(wěn)定的不可逆的AGEs[2]。AGEs具有高度的反應(yīng)活性。在正常生理過(guò)程中，這種反應(yīng)難以完全避免，但是如果反應(yīng)過(guò)度，高水平的AGEs進(jìn)入組織器官當(dāng)中，就會(huì)造成組織損害，破壞正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而引發(fā)一系列疾病。因此，AGEs幾乎被看作是毒素，在糖尿病和多種慢性病當(dāng)中，都是人體的重要致病因素[3]。

1.2AGEs的作用機(jī)制AGEs對(duì)組織的損害主要通過(guò)兩個(gè)途徑。首先，AGEs改變了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的性質(zhì)，AGEs的形成通常需要幾個(gè)月甚至幾年時(shí)間，因此AGEs主要修飾長(zhǎng)壽的分子，例如膠原等，從而形成不溶的、功能下降的復(fù)合物，且隨著時(shí)間推移，形成增多[4]。糖化的膠原交聯(lián)增加使得其彈性下降，這解釋了AGEs與心血管疾病的關(guān)系。其次，細(xì)胞膜上的AGEs受體（AGER）可介導(dǎo)糖化基質(zhì)的攝取、吸收和降解，例如在巨噬細(xì)胞，AGER攝取糖化基質(zhì)后產(chǎn)生低分子質(zhì)量、可溶性的“第二代AGEs”,然后“第二代AGEs”離開(kāi)細(xì)胞,進(jìn)入血液，進(jìn)入腎臟后發(fā)生免疫反應(yīng)，改變腎臟蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)腎臟生理功能造成損害[5-7]。AGEs在進(jìn)入肝臟后形成交聯(lián)的AGE復(fù)合物 ，大部分復(fù)合物被庫(kù)普弗細(xì)胞（Kupffer 細(xì)胞）和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞和降解，肝臟對(duì)“第二代AGEs”的降解可以阻止糖尿病并發(fā)癥、心血管病等疾病的發(fā)生。但是過(guò)量的AGE復(fù)合物與內(nèi)皮細(xì)胞表面的AGER 相互作用，會(huì)改變內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使其通透性增加，進(jìn)而促進(jìn)凝血反應(yīng)，在使抗凝物質(zhì)減少的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加[8]。因此，AGEs的形成加劇了一些慢性疾病如糖尿病、肝硬化、腎功能衰竭、心血管疾病、阿爾茨海默病等的病理過(guò)程。

2　皮膚自發(fā)熒光是AGEs 的重要檢測(cè)手段

AGEs是體內(nèi)產(chǎn)生的異源性化合物，因此，尋求合適的檢測(cè)手段定量測(cè)定AGEs的積聚量具有重要意義。以往AGEs的檢測(cè)方法主要是針對(duì)血漿或血清，利用分光光度技術(shù)和斯派克熒光技術(shù)，根據(jù)AGEs的熒光特征屬性(在370 nm激發(fā)，在440 nm發(fā)射)對(duì)低分子質(zhì)量的AGEs進(jìn)行測(cè)定[9-10]，或采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定AGEs的可溶性受體碎片。但是，根據(jù)可溶性AGER的水平來(lái)定量檢測(cè)血清和組織中AGEs積聚量的準(zhǔn)確性值得懷疑，并且,這種方法也沒(méi)有考慮到其他配體與AGER結(jié)合對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。這種缺乏一致性的分析只能作為AGEs的大致分析數(shù)據(jù)而不能用于臨床檢測(cè)。此外，血漿或血清中AGEs的檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確反映視網(wǎng)膜、腎臟、血管壁等組織中AGEs的積聚量。另外，由于體內(nèi)AGEs可以通過(guò)腎臟排出體外，因此體內(nèi)AGEs的積聚量也與腎功能密切相關(guān)[11]。當(dāng)檢測(cè)出血漿或血清內(nèi)AGEs升高時(shí)很難解釋是由于腎臟本身的疾病還是由于其他疾病所導(dǎo)致。大多數(shù)情況下通過(guò)組織檢測(cè)的結(jié)果更能準(zhǔn)確地反應(yīng)體內(nèi)AGEs的積聚水平，且以測(cè)量皮膚組織中AGEs積聚量為最佳[12]。雖然檢測(cè)組織中AGEs的水平能更好地反映AGEs長(zhǎng)期積聚導(dǎo)致的組織損傷，但是組織活檢是侵入性檢查，會(huì)對(duì)檢查者造成額外的傷害。因此，尋求簡(jiǎn)單且容易操作的臨床檢測(cè)手段非常必要。皮膚自發(fā)熒光檢測(cè)-糖基化檢測(cè)儀（AGE-Reader）,不僅滿(mǎn)足了無(wú)創(chuàng)性要求，而且在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中被證明是能夠準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)AGEs水平的重要檢測(cè)手段[13]。

AGE-Reader根據(jù)AGE的熒光特性來(lái)測(cè)量AGE在皮膚組織中的積累水平。它用激發(fā)光源照射面積約4 cm2的皮膚組織，分光計(jì)測(cè)量發(fā)射光(熒光，波長(zhǎng)420～600 nm)和反射的激發(fā)光(波長(zhǎng)300～420 nm，峰值在370 nm的紫外光),皮膚自發(fā)熒光的計(jì)算為發(fā)射光和反射的激發(fā)光的比值乘以100,表示任意單元[14]。因?yàn)槠つw本身顏色會(huì)吸收光線(xiàn)從而影響自發(fā)熒光測(cè)量,因此皮膚反射在300～420 nm范圍的光會(huì)與一塊白色聚四氟乙烯(假設(shè)反射100%)進(jìn)行對(duì)比以控制誤差[15]。AGE-Reader檢測(cè)皮膚自發(fā)熒光的方法是，取前臂掌側(cè)皮膚（肘關(guān)節(jié)以下10 cm）以及小腿后側(cè)皮膚，在無(wú)燈光照射的房間內(nèi)檢測(cè)以避免周?chē)饩€(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，選擇光滑、平整的皮膚區(qū)域，避免因受測(cè)區(qū)皮膚不平整（如突出的血管、瘢痕等）而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。檢測(cè)分兩步進(jìn)行：第一步是校準(zhǔn)，首先測(cè)暗電流以校正電荷耦合設(shè)備光感受器的噪音，然后確定反射率，以白光反射為標(biāo)準(zhǔn)（假設(shè)100%反射）；第二步是進(jìn)行皮膚自發(fā)熒光的測(cè)定，收集所有從皮膚發(fā)射的300～600 nm波長(zhǎng)的光線(xiàn)，在420～600 nm波長(zhǎng)之間的光線(xiàn)被看作是皮膚發(fā)射形成，分光計(jì)測(cè)量數(shù)值，以發(fā)射光和反射的激發(fā)光的比值再乘以100為皮膚自發(fā)熒光值。測(cè)定50次，取其平均值作為檢測(cè)結(jié)果，以保證最佳可重復(fù)性結(jié)果。

3　皮膚自發(fā)熒光對(duì)于糖尿病監(jiān)測(cè)及其并發(fā)癥診斷的重要意義

糖尿病及出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥時(shí)，主要通過(guò)檢測(cè)皮膚自發(fā)熒光來(lái)反映AGEs的積聚量，再進(jìn)一步研究AGEs與疾病的關(guān)系。AGEs是長(zhǎng)期積累的糖化產(chǎn)物，而糖尿病本身就是糖代謝紊亂的慢性消耗性疾病，其并發(fā)癥也是AGEs長(zhǎng)期積累所致。因此，檢測(cè)皮膚自發(fā)熒光對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的診斷和判斷疾病進(jìn)程具有重要意義。

3.1皮膚自發(fā)熒光檢測(cè)與1型糖尿?。═1DM）研究表明，通過(guò)測(cè)定AGEs來(lái)監(jiān)測(cè)T1DM糖尿病患者的胰島素水平，與檢測(cè)糖化血紅蛋白相比具有更長(zhǎng)回溯期并且簡(jiǎn)便無(wú)創(chuàng)[15]。Sugisawa等[16]的觀點(diǎn)與上述觀點(diǎn)一致，認(rèn)為通過(guò)測(cè)定AGEs不僅可以監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期胰島素控制水平，而且發(fā)現(xiàn)AGEs的積累量與T1DM的心血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。Genevieve等[17]的研究表明，皮膚自發(fā)熒光與T1DM血糖長(zhǎng)期控制情況和相關(guān)并發(fā)癥（如視網(wǎng)膜病變、蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率下降等）有著必然的聯(lián)系。而 Chabroux等[18]的研究也表明，腎病并發(fā)癥和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥與皮膚自發(fā)熒光具有一定的相關(guān)性，但視網(wǎng)膜病變與皮膚自發(fā)熒光不具有相關(guān)性，是否吸煙、性別和體脂肪健康指數(shù)也與皮膚自發(fā)熒光無(wú)相關(guān)性。上述兩項(xiàng)研究中關(guān)于T1DM視網(wǎng)膜病變與皮膚自發(fā)熒光關(guān)系的結(jié)論并不一致，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.2皮膚自發(fā)熒光檢測(cè)與2型糖尿?。═2DM）荷蘭研究人員的一項(xiàng)研究結(jié)果表明,皮膚自發(fā)熒光可作為評(píng)估T2DM患者血管受損的標(biāo)志物[19]。研究者使用峰值強(qiáng)度為370 nm的熒光管對(duì)參試者的前臂皮膚進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn), T2DM患者的平均皮膚自發(fā)熒光強(qiáng)度比健康對(duì)照組高33%,且并發(fā)大血管病變和微血管病變的患者具有更高的自發(fā)熒光水平。英國(guó)前瞻性糖尿病研究結(jié)果認(rèn)為,皮膚自發(fā)熒光強(qiáng)度對(duì)T2DM患者心血管并發(fā)癥的預(yù)后有預(yù)示作用，并且可以識(shí)別潛伏期的心血管問(wèn)題[20]。Noordzij等[21]研究證實(shí)T2DM患者心血管并發(fā)癥與皮膚自發(fā)熒光強(qiáng)度具有獨(dú)立相關(guān)性。Monami等[22]認(rèn)為，對(duì)于T2DM患者，皮膚自發(fā)熒光強(qiáng)度不僅與患者高血糖的程度有關(guān)，而且還與年齡、吸煙、肥胖和代謝綜合征等因素相關(guān)。

3.3T1DM和T2DM共同作用AGEs的積累對(duì)兩種類(lèi)型糖尿病的并發(fā)癥也有共同的影響。Hang等[23]的研究表明，AGEs無(wú)論在T1DM還是在T2DM中對(duì)視網(wǎng)膜都有損害，影響視覺(jué)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)AGEs可以檢測(cè)糖尿病黃斑水腫的進(jìn)展和視覺(jué)功能。Shen等[24]認(rèn)為，AGEs與糖尿病足的發(fā)生具有相關(guān)性，在篩查糖尿病足風(fēng)險(xiǎn)中具有一定的意義。

4　結(jié) 論

糖尿病是糖代謝紊亂造成的慢性消耗性疾病，伴隨而來(lái)的并發(fā)癥以及炎癥反應(yīng)給糖尿病患者帶來(lái)了長(zhǎng)期痛苦。創(chuàng)傷的延遲愈合或者遷延不愈是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，有研究表明與AGEs受體有著密不可分的關(guān)系[25]。皮膚自發(fā)熒光可測(cè)量組織中AGEs的積聚量,因此可以通過(guò)自發(fā)熒光波譜或強(qiáng)度的變化來(lái)觀察糖尿病的進(jìn)程。此方法無(wú)創(chuàng)、易操作，只需要一個(gè)暗環(huán)境和一臺(tái)計(jì)算機(jī)就可以完成，不會(huì)給患者帶來(lái)任何痛苦。

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DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 019

基金項(xiàng)目：國(guó)家973計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012CB518105）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81121004, 81230041, 81171798）

通訊作者：趙志力,副主任醫(yī)師（E-mail: zhilizhao@vip.sina.com）張翠萍，副研究員（E-mail: zcp666666@sohu.com）

收稿日期：（2015-12-18）