王彬彬　張翠萍　趙志力　付小兵　王 麗（.內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院整形美容科，內蒙古 呼和浩特 0007；.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 00048；. 北京軍區(qū)總醫(yī)院整形美容中心,北京 00700）

?

小汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象的觀察

王彬彬1張翠萍2趙志力3付小兵2王 麗2
（1.內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院整形美容科，內蒙古 呼和浩特 010017；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048；3. 北京軍區(qū)總醫(yī)院整形美容中心,北京 100700）

【摘要】目的：觀察小汗腺是否具有自發(fā)熒光現(xiàn)象及其隨汗腺細胞生長、衰老的變化，推測其發(fā)光基團，探討研究小汗腺的新方法。方法：取整形美容患者棄用的皮膚組織，蘇木素染色，奧林巴斯倒置相差顯微鏡觀察小汗腺組織的自發(fā)熒光現(xiàn)象。從皮膚中提取單個汗腺細胞進行體外培養(yǎng)，于汗腺細胞貼壁后7、14、21、28 d在奧林巴斯倒置相差顯微鏡分別以紫外光、綠光、藍光3種不同激發(fā)光照射，觀察小汗腺自發(fā)熒光的變化情況；利用激光掃描共聚焦顯微鏡γ掃描測量小汗腺自發(fā)熒光的強度。結果：蘇木素染色后的小汗腺組織自發(fā)熒光表現(xiàn)為似有小孔的網(wǎng)狀結構，小汗腺邊界清晰，其自發(fā)熒光在藍色激發(fā)光下表現(xiàn)為綠色自發(fā)熒光，綠色激發(fā)光下表現(xiàn)出紅色自發(fā)熒光；單獨的小汗腺細胞在熒光顯微鏡下表現(xiàn)出更多顏色的自發(fā)熒光，紫外光的激發(fā)下顯示出藍色的自發(fā)熒光，藍色的激發(fā)光下顯示出綠色自發(fā)熒光，綠色的激發(fā)光下顯示出紅色的自發(fā)熒光，隨小汗腺的生長，熒光強度沒有明顯變化；用激光掃描共聚焦顯微鏡γ分層掃描方法測定小汗腺自發(fā)熒光強度，分別在近530 nm和590 nm處發(fā)現(xiàn)兩個自發(fā)熒光峰值，與黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值相近。結論：通過觀察蘇木素染色后小汗腺組織的自發(fā)熒光可以簡單、快速地幫助判斷小汗腺結構。單個汗腺細胞的自發(fā)熒光強度隨汗腺生長沒有明顯減弱。根據(jù)小汗腺自發(fā)熒光的峰值測定初步判定小汗腺自發(fā)熒光的發(fā)光基團是黃素和脂褐素。

關鍵詞小汗腺自發(fā)熒光熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡黃素脂褐素

自發(fā)熒光是組織固有的性質。皮膚自發(fā)熒光產生的原因在于皮膚組織中存在熒光基團，在某些病理變化中皮膚還會產生內源性和外源性的熒光基團[1-2]。人體的汗腺分為大汗腺與小汗腺兩種，它們在調節(jié)人體生理活動中不可缺少。大汗腺主要分布于腋窩和生殖器部位的真皮深層，不參與體溫調節(jié)。小汗腺分部在除了唇緣、甲床、乳頭、生殖器外的皮膚組織，主要負責分泌汗液調節(jié)體溫。對汗腺的深入研究可以提高對疾病狀態(tài)（如無汗癥或多汗癥）下器官、組織、細胞和分子影響的認識[3-4]。因此，了解汗腺由不同疾病導致的功能和結構的變化具有重要臨床意義。關于汗腺的生理病理指標以及汗腺損傷后的再生一直是科研難題，汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象也鮮有報道。我們曾經(jīng)在離體汗腺細胞的培養(yǎng)中，觀察到小汗腺在熒光顯微鏡下有自發(fā)熒光現(xiàn)象。本研究中，我們在奧林巴斯倒置相差顯微鏡下觀察了小汗腺組織自發(fā)熒光的特點及其隨汗腺細胞生長、成熟、衰老的變化，采用共聚焦掃描顯微鏡檢測了小汗腺自發(fā)熒光強度，報告如下。

1　材料和方法

1.1實驗儀器倒置相差顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)（奧林巴斯IX71，日本），顯微鏡自帶3種激發(fā)光：藍色激發(fā)光(430～500 nm),綠色激發(fā)光(500～560 nm),紫外線激發(fā)光(< 430 nm)。激光掃描共聚焦顯微鏡 (LCSM， Leica-SP8STWS，德國)。自發(fā)熒光淬滅劑C1212（北京普利萊技術有限公司)。

1.2皮膚組織中小汗腺組織自發(fā)熒光觀察取北京軍區(qū)總醫(yī)院激光整形美容中心患者手術棄用皮膚組織，包括手部以及腹部皮膚，患者同意并簽署知情同意書。 4例患者中男2例，女2例；年齡23~56歲。手術過程均嚴格禁止任何腐蝕性操作以免破壞汗腺組織。將新鮮皮膚組織剪成約1 cm×1 cm×1 cm的皮片，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、 切片（厚5 μm），蘇木素染色，倒置相差顯微鏡下觀察皮膚組織中的小汗腺形態(tài)和其自發(fā)熒光特點。染色后的汗腺組織用蒸餾水沖洗后，放入平皿中，加入覆蓋切片的淬滅劑，室溫下孵育60 min ；吸去淬滅劑，蒸餾水短暫沖洗；吸去蒸餾水，PBS沖洗3次，奧林巴斯倒置相差顯微鏡下觀察熒光是否具有特異性。

1.3分離培養(yǎng)小汗腺組織自發(fā)熒光的觀察取新鮮皮膚組織去掉皮下脂肪層，D-Hanks液浸洗去除血液，剪成約1 mm×1 mm×1 mm的皮粒，放入60 ml培養(yǎng)皿中，加入5 ml（2 mg/ml）Ⅱ型膠原酶，混勻后置于37 ℃、5﹪CO2孵箱中8～12 h，倒置相差顯微鏡下用無菌移液槍。吸取游離的小汗腺細胞，分別置于普通培養(yǎng)皿以及Confocal皿中，加入配制好的汗腺培養(yǎng)基(在DMEM培養(yǎng)基的基礎上，添加10%的胎牛血清，重組人表皮生長因子10 ng/100 ml,三碘甲狀腺原氨酸2 nmol/ml,半琥珀酰氫化可的松0.4 μg/ml,胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉1 ml/100 ml,青霉素100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml )， 48～72 h后汗腺細胞貼壁后每3 d更換1次培養(yǎng)基。于細胞貼壁后7 d，將裝有貼壁汗腺細胞的培養(yǎng)皿置于倒置相差顯微鏡載物臺上，分別以紫外光、藍光、綠光照射汗腺團，觀察小汗腺自發(fā)熒光圖像，每隔7 d拍照，觀察小汗腺自發(fā)熒光隨汗腺細胞生長的變化情況，觀察至汗腺細胞貼壁后28 d。

為了選擇最優(yōu)熒光觀測區(qū)域，需要考慮到衰減可能性和保證適當?shù)男盘栐肼暠?，首先在顯微鏡下選擇一個合適的區(qū)域觀察單獨的小汗腺細胞，測定自發(fā)熒光的時機選擇在肉眼觀察熒光最明顯時的激發(fā)光處。

1.4激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描當汗腺細胞貼壁以后，將種植于Confocal皿中的小汗腺細胞置于載物臺，調整合適的視野和肉眼可見熒光最明顯處的光圈大小，激光掃描共聚焦顯微鏡λ模式分層掃描，觀察測量小汗腺自發(fā)熒光強度。

2　結 果

2.1汗腺組織自發(fā)熒光特點蘇木素染色后的汗腺組織自發(fā)熒光表現(xiàn)為似有小孔的網(wǎng)狀結構。小汗腺邊界非常清晰,倒置相差顯微鏡藍色激發(fā)光下綠色熒光和綠色激發(fā)光下紅色熒光清楚,但紫外線下激發(fā)光沒有顯示自發(fā)熒光現(xiàn)象。熒光猝滅劑無法將熒光淬滅，表明汗腺自體熒光無特異性。圖1（見封二）。2.2小汗腺生長過程中自發(fā)熒光變化從皮膚組織中分離出小汗腺進行培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下在明敞視野下觀察，并分別以紫外光、藍光、綠光為激發(fā)光源照射汗腺，可以分別觀察到藍色、綠色以及紅色的自發(fā)熒光，且各種自發(fā)熒光強度均較強，汗腺團結構清晰，可以清晰分辨出汗腺導管部，汗腺導管熒光強度部較其他部位稍強。汗腺細胞貼壁后7、14、21、28 d，肉眼觀察到汗腺自發(fā)熒光隨汗腺生長及衰老并沒有明顯變化。圖2（見封二）。2.3激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描小汗腺熒光大小在激光掃描共聚焦顯微鏡λ模式分層掃描下，小汗腺表現(xiàn)出綠色自發(fā)熒光時，500～620 nm激發(fā)光范圍內出現(xiàn)了兩個自發(fā)熒光高峰，隨機取圖片中的6個點，根據(jù)其自發(fā)熒光值制圖，發(fā)現(xiàn)峰值出現(xiàn)在近530 nm和590 nm處（圖3,見封二）；在小汗腺表現(xiàn)出紅色自發(fā)熒光時， 570～700 nm激發(fā)光范圍內出現(xiàn)了一個自發(fā)熒光峰值，隨機取圖片中的6個點，根據(jù)其自發(fā)熒光值制圖，其峰值出現(xiàn)在近590 nm處（圖4，見封二）。上述峰值與黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值相近[2]，推測引起小汗腺自發(fā)熒光的物質為黃素和脂褐素。

3　討 論

當用一種波長的光照射某種物質時，這種物質得到光子，激發(fā)自身產生比照射光波長更長的可見光，這種現(xiàn)象稱為自發(fā)熒光。在醫(yī)學方面，自發(fā)熒光研究主要集中于視網(wǎng)膜疾病、呼吸系統(tǒng)腫瘤等相關疾病的病理過程研究、診斷和治療[5-6]。

近年來，醫(yī)學方面關于汗腺的研究主要集中在汗腺的再生與修復基因調控、相關蛋白和通道方面[7-12]，而關于汗腺光學特點的研究鮮有報道。組織中的自發(fā)熒光基團主要存在于細胞外基質中，如膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維中，而這些纖維組織是細胞構架的主要組成部分，我們猜測這些組織構架應該可以通過組織的自發(fā)熒光來觀察到[2]，而且，通過研究小汗腺組織自發(fā)熒光圖像來確定小汗腺的結構較光學顯微鏡觀察簡單、快速。我們的研究清楚地顯示了皮膚組織中小汗腺在不同狀態(tài)下的自發(fā)熒光現(xiàn)象，可以清晰地觀察到綠色和紅色的自發(fā)熒光,并且不會衰減，不能被熒光淬滅劑淬滅?？梢?這種自發(fā)熒光具有非特異性[1-2]。

我們觀察到，離體的汗腺細胞顯示了不同顏色的自發(fā)熒光，而且隨汗腺的生長、成熟和老化，熒光并沒有明顯改變，說明汗腺組織中引起自發(fā)熒光的物質沒有隨汗腺的新陳代謝而明顯減少。細胞的自發(fā)熒光主要由內在熒光基團發(fā)出，如黃素和脂褐素等。黃素是在大多數(shù)代謝途徑（如糖、蛋白質、脂肪和核酸的代謝通路）中必不可少的輔酶，其氧化和減少會產生不同量子產率。測量自發(fā)熒光可以用于監(jiān)測細胞和組織能量代謝，反映細胞的新陳代謝水平[2,13]。采用激光掃描共聚焦顯微鏡測定，我們發(fā)現(xiàn)小汗腺自發(fā)熒光有兩個峰值，分別接近于530 nm和590 nm。黃素參與細胞的呼吸鏈，其自發(fā)熒光來源于氧化反應，熒光峰值在520 nm；脂褐素是細胞老化的標志物，隨著新陳代謝逐漸增加，其自發(fā)熒光峰值在近600 nm[2]，與所測小汗腺細胞峰值均相近。由于黃素和脂褐素的自發(fā)熒光峰值與本研究中所測得的小汗腺自發(fā)熒光峰值接近，因此推測引起小汗腺細胞發(fā)生自發(fā)熒光的物質很有可能是黃素和脂褐素。黃素隨新陳代謝逐漸減少，脂褐素則隨新陳代謝有所增加，這可能是小汗腺的自發(fā)熒光隨新陳代謝沒有明顯變化的原因。

小汗腺自發(fā)熒光特點除了與自發(fā)熒光物質有關外，其他影響因素包括切片的厚度和光源選擇[2,14]、生理病理情況、培養(yǎng)基以及溫度等。本實驗中，我們對所用到的器皿作了嚴格處理，以充分減少背景熒光對實驗的干擾。我們觀察所用的汗腺細胞均貼壁并且生長狀態(tài)良好，各項操作均遵循了無菌操作原則。觀察小汗腺自發(fā)熒光時嚴格控制時間以免造成汗腺細胞活性降低，影響實驗結果。本研究結果顯示，蘇木素染色皮膚組織的自發(fā)熒光有助于幫助辨別小汗腺的組織結構。單個小汗腺表現(xiàn)出自發(fā)熒光現(xiàn)象可能是由于存在自身熒光基團—黃素和脂褐素，其與小汗腺新陳代謝的關系還需要進一步研究。

參考文獻

［1］Patalay R, Talbot C, Alexandrov Y, Munro I, Neil MA, K?nigK, French PM, Chu A, Stamp GW, Dunsby C. Quantification of cellular autofluorescence of human skin using multiphoton tomography and fluorescence lifetime imaging in two spectral detection channels[J]. Biomed Opt Express, 2011 ,2(12):3295-3308.

［2］Monici M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications[J]. Biotechnol Annu Rev, 2005,11:227-256.

［3］Quinton PM. Cystic fibrosis: lessons from the sweat gland[J]. Physiology (Bethesda), 2007 ,22:212-225.

［4］No?l F, Piérard-Franchimont C, Piérard GE, Quatresooz P. Sweaty skin, background and assessments[J]. Int J Dermatol, 2012 ,51(6):647-655.

［5］Zhang P, Wang HY, Zhang ZF, Sun DJ, Zhu JT, Li J, Wang YS. Fundus autofluorescence in central serous chorioretinopathy: association with spectral-domain optical coherence tomography and fluorescein angiography[J]. Int J Ophthalmol,2015,8(5):1003-1007.

［6］Divisi D, Di Tommaso S, De Vico A, Crisci R. Early diagnosis of lung cancer using a SAFE-3000 autofluorescence bronchoscopy[J]. Interact Cardiovasc Thorac Surg, 2010,11(6):740-744.

［7］Zhao Z, Xu M, Wu M, Ma K, Sun M, Tian X, Zhang C, Fu X. Direct reprogramming of human fibroblasts into sweat gland-like cells[J]. Cell Cycle， 2015,14(21):3498-3505.

［8］陳艷 ,趙洪良, 譚志軍, 趙煥軍，張翠萍， 付小兵.人骨髓間充質干細胞向汗腺樣細胞誘導分化的研究[J]. 感染、 炎癥 、修復,2014,15(2) ：76-78.

［9］許永安，馬奎、付小兵,張翠萍. 臍帶間充質干細胞向汗腺樣細胞分化后的表型變化[J]. 感染、 炎癥 、修復 ,2011,12(1)： 16-19.

［10］馬奎，魯剛，楊思明,孫同柱，付小兵，盛志勇. 汗腺樣細胞經(jīng)凍存復蘇后再生汗腺功能的研究[J]. 感染、 炎癥 、修復,2011,12(4)： 202-204.

［11］Xie J, Yao B, Han Y, Shang T, Gao D, Yang S, Ma K, Huang S, Fu X. Cytokeratin Expression at Different Stages in Sweat Gland Development of C57BL/6J Mice[J]. Int J Low Extrem Wounds， 2015,14(4):365-371.

［12］Cui CY, Sima J, Yin M, Michel M, Kunisada M, Schlessinger D. Identification of potassium and chloride channels in eccrine sweat glands. J Dermatol Sci， 2016 ，81(2):129-131.

［13］Li H, Fu X, Ouyang Y, Cai C, Wang J, Sun T. Adult bonemarrow-derived mesenchymal stem cells contribute to wound healing of skin appendages[J]. Cell Tissue Res， 2006 ,326(3):725-736.

［14］Van de Lest CH, Versteeg EM, Veerkamp JH, Van Kuppevelt TH. Elimination of autofluorescence in immunofluorescence microscopy with digital image processing[J]. J Histochem Cytochem， 1995 ,43(7):727-730.

Observation on autofl uorescence of eccrine sweat gland

Wang Binbin*, Zhang Cuiping, Zhao Zhili, Fu Xiaobing, Wang Li. * Department of Burns Plastic Surgery, Inner Mongolia People's Hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010017, China Corresponding author: Zhao Zhili (E-mail: zhilizhao@vip.sina.com)
Zhang Cuiping(E-mail: zcp666666@sohu.com)

AbstractObjective: To observe the autofluorescence phenomena of eccrine sweat glands and its changes with the growth or aging of eccrine sweat glands, and speculate the endogenous fluorophores to provide a new method for the study of eccrine sweat glands. Methods: Abandoned skin tissues of patients receiving the plastic surgery were collected and stained with haematoxylin-eosin (HE) to observe autofluorescence of eccrine sweat glands under a fluorescence microscope. Single eccrine sweat gland was extracted from the skin of volunteers and cultured in vitro. At 7, 14, 21, 28 days after cell adherence, the autofluorescence was observed after the cells was exposed to three kinds of exciting light respectively, wide ultraviolet, wide green, and wide blue, under the fluorescence microscope. The autofluorescence intensity of the single eccrine sweat gland was measured using a laser confocal scanning microscope. Results: Autofluorescence of HE stained eccrine sweat glands showed net structure with ostioles, and the boundary was clear. The autofluorescence of the eccrine sweat glands appeared green under wide blue excitation light and red under wide green excitation light. Moreover, the single eccrine sweat gland cell showed three autofluorescence colours under fluorescence microscope, including blue under wide ultraviolet, green under wide blue light and red under wide green light. The fluorescence intensity of the single eccrine sweat gland cell didnot decrease significantly with its growth. The result of the intensity of single eccrine sweat gland detected by hierarchical scanning using the laser confocal scanning microscope showed that two peaks were located at approximately 530 nm and 590 nm, which were similar to those of flavin and lipofuscin. Conclusions: Autofluorescence of HE-stained eccrine sweat gland sections in skin tissue is helpful for simply and rapidly judging the structure of eccrine sweat glands. Autofluorescence of single eccrine sweat gland does not decrease significantly along with its growth. According to autofluorescence intensity of the eccrine sweat gland, it is thought that flavin and lipofuscin may be the endogenous fluorophores.

Key words:Eccrine sweat gland;Autofluorescence;Fluorescence microscope;Confocal laser scanning microscope;Flavin;Lipofuscin

DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 003

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81571905）

通訊作者：趙志力，副主任醫(yī)師（E-mail: zhilizhao@vip.sina.com）通訊作者：張翠萍，副研究員（E-mail: zcp666666@sohu.com）

收稿日期：（2015-12-25）