李　琳　邢　輝　覃小敏　周　敏

作者單位：441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

VEGF-C表達與子宮頸癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

李琳邢輝覃小敏周敏

作者單位：441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的 探討VEGF-C與子宮頸癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法對82例行宮頸癌根治術(shù)治療的患者進行mRNA和ELISA檢測，分析VEGF-C在腫瘤中的表達。結(jié)果VEGF-C表達高的多發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表達低的患者多數(shù)未發(fā)生轉(zhuǎn)移，且具有統(tǒng)計學比較意義(P=0.046)。結(jié)論在宮頸癌轉(zhuǎn)移患者體中VEGF-C表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，VEGF-C極有可能成為宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子標志物。

【關(guān)鍵詞】VEGF-C；子宮頸癌；前哨淋巴結(jié)；轉(zhuǎn)移

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:050～052)

據(jù)研究表明，現(xiàn)在宮頸癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，發(fā)病人群也逐漸年輕化，其易轉(zhuǎn)移至其他部位是導致其難治愈的一個重要原因[1-2]。前哨淋巴結(jié)作為重要的預后因子參與早期宮頸癌轉(zhuǎn)移，前哨淋巴結(jié)的形態(tài)學研究在早期宮頸癌已被廣泛研究[3-4]。前哨淋巴結(jié)的評估被看作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移級數(shù)的指標，被用于指導患者手術(shù)治療和放療化療，而且還被用作指導切除腫瘤部位[5-6]。

表皮生長因子C(VEGF-C)，是VEGF家族中的一名成員，刺激增殖，促進淋巴管的生成和血管新生[7]。據(jù)研究表明，VEGF-C在腫瘤組織中的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，在宮頸癌中VEGF-C的表達和淋巴結(jié)的浸潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)系[8-9]。但是VEGF-C在前哨淋巴結(jié)中的作用和其對宮頸癌的影響還尚未清楚，基于此，我們開展了如下研究。

1材料與方法

1.1　臨床資料

選取2011年到2013年于我院婦科進行宮頸癌根治術(shù)治療的宮頸癌患者為研究對象，在我們研究中，≥50歲39例，<50歲患者43例；FIGO分期：ⅠB 39例，ⅡA 43例；高/中分化36例，低分化46例；腫瘤直徑≥4 cm 35例，<4 cm 47例；鱗癌71例，腺癌11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，未轉(zhuǎn)移46例。

1.2　方法

1.2.1RT-PCR試劑及方法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，引物VEGF-C.F：5′-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3′，R：5′-CCACATCTGTAGACGGACAC-3′；GAPDH.F：GGTGAAGGTCGGTGTGAACG，R：CTCGCTCCTGGAAGATGGTG合成于Invitrogen，USA。稱取等量組織，加入同等比例的Trizol，研磨組織，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數(shù)次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴增程序為35個循環(huán)，程序為95 ℃ 3 min，95 ℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃50 s，72 ℃10 min。

1.2.2VEGF-C ELISAHumanVEGF-C ELISA(ELH-VEGF-C)試劑購自于廣州瑞博奧生物科技有限公司。準備試劑和標準品。每孔添加100 μl樣品和標準品，37 ℃反應90 min，不洗。每孔添加100 μl生物素標記抗體，37 ℃反應60 min。0.01M TBS洗滌3次。每孔添加100 μl ABC，37 ℃反應30 min。0.01M TBS洗滌5次。TMB 37 ℃避光反應30 min以內(nèi)。加入TMB終止液，讀數(shù)。

1.3　統(tǒng)計學處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理，統(tǒng)計學方法采用t檢驗，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1　VEGF-C在前哨淋巴結(jié)中的表達

在提取組織RNA經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成CDNA后進行RT-PCR分析，在我們所研究的組織中有的組織存在高表達現(xiàn)象，有的存在低表達現(xiàn)象，其中高表達41例，低表達41例，我們規(guī)定如圖1中1所示為高表達VEGF-C，2所示為低表達VEGF-C。將高表達患者進行統(tǒng)計整理。

1為高表達，2為低表達。

2.2　ELISA進行檢測VEGF-C在組織中的表達

上述我們已經(jīng)證實有些患者組織中會存在VEGF-C mRNA的高表達，緊接著我們進行蛋白水平的檢測，在患者組織中我們將提取到的組織蛋白進行ELISA檢測，得到標準曲線Y=-1157.2X3+1927.6X2+4680.5X+8.592，根據(jù)說明書來看此標曲完全符合，然后將在紫外450 nm處讀出數(shù)值。正常組織中VEGF-C的正常值為2 459～6 651 pg/mL，將高于此值的我們規(guī)定為高表達VEGF-C，共47例，平均值(8258±1430)pg/mL；同理將低于此值的我們規(guī)定為低表達組，共35例，(4271±1546)pg/mL。高低表達組患者組織VEGF-C差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3　VEGF-C的表達與患者臨床特征的關(guān)系

在我們研究中我們將患者中mRNA VEGF-C高表達患者且同時ELISA VEGF-C高表達患者進行病理檢查，在我們檢查中發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達患者與其轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，也就是說VEGF-C高表達患者組與低表達VEGF-C患者組相比，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多，將各分類中的VEGF-C陰性與VEGF-C陽性比進行統(tǒng)計，統(tǒng)計得出VEGF-C在未轉(zhuǎn)移患者和轉(zhuǎn)移患者中表達有統(tǒng)計學差異，且P<0.05，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1　VEGF-C在各分類中的表達情況

3　討論

宮頸癌是人類疾病中惡性程度較高的一類疾病，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移是導致其難治愈的一個主要原因。轉(zhuǎn)移的腫瘤通過血液、淋巴管，進而形成多種其他腫瘤。淋巴管的轉(zhuǎn)移包括一系列的復雜過程，包括①原位癌惡性腫瘤細胞擴散至旁邊淋巴管；②腫瘤細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)運至鄰近的淋巴結(jié)；③腫瘤細胞在淋巴結(jié)中的著落；④轉(zhuǎn)移性的腫瘤在淋巴結(jié)中的擴散[9-10]。

最近的研究多集中在VEGF家族在宮頸癌中的作用，特別是VEGF-C。VEGF-C是在1996年從人前列腺癌PC-3細胞株中分離出來，其位于染色體4q34，在其編碼外端有7個外顯子，是人類發(fā)現(xiàn)的第1個具有促進淋巴管生成的基因[11-12]。VEGF-C具有誘導淋巴管生成和血管新生的潛能，且能調(diào)節(jié)生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF-C在腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲浸潤中發(fā)揮著重要作用[13]。

基于此本研究展開在宮頸癌前哨淋巴結(jié)中進行VEGF-C的研究。在我們的研究中我們首先對宮頸癌患者腫瘤組織進行mRNA的檢測，進而利用ELISA進行蛋白表達檢測，在兩項檢測均為高表達患者中進行歸類，然后進行臨床數(shù)據(jù)的整理，經(jīng)我們統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)VEGF-C高的多發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表達低的患者多數(shù)未發(fā)生轉(zhuǎn)移，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.046)。所以我們初步得出結(jié)論：在宮頸癌轉(zhuǎn)移患者體中VEGF-C表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。我們認為在今后研究愈加深入后VEGF-C極有可能成為宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子標志物。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between VEGF-C Expression and Sentinel Lymph Node

Metastasis of Cervical Cancer

LILin，XINGHui，QINXiaomin，etal.HubeiCentralHospitalofXiangyang，Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo detect the relationship of VEGF-C expression and sentinel lymph node metastasis of cervical cancer.Methods82 cases of cervical cancer were detected by RT-PCR and ELISA，and the expressions of VEGF-C was analyzed.ResultsPatients with high expression of VEGF-C had high lymph node metastasis rate，most patients with low expression of VEGF-C had no lymph node metastasis，there had significant difference(P=0.046).ConclusionThe correlative VEGF-C with lymph node metastasis are positive and VEGF-C may be the molecular markers for cervical cancer.

【Key words】VEGF-C；Cervical cancer；Sentinel lymph node；Metastasis

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0050-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.015

通訊作者：周敏

收稿日期(2012-11-12修回日期 2013-05-21)