劉　軒　王潤秀　吳小云　謝富華

Survivin RNAi聯(lián)合PsL 5F影響MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的研究

劉軒王潤秀吳小云謝富華

【摘要】目的探討RNAi介導(dǎo)的基因治療聯(lián)合天然藥物半邊旗提取物5F(PsL 5F)對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法采用腺病毒介導(dǎo)Survivin RNAi聯(lián)合PsL 5F作用乳腺癌細(xì)胞MCF-7，免疫印跡法檢驗Survivin被沉默的程度，通過MTT檢測細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白的表達(dá)明顯被抑制；MTT實驗表明聯(lián)合作用對細(xì)胞增殖的抑制作用從單獨(dú)應(yīng)用的50.00%(P<0.001)，提高到86.12%(P<0.001)；流式細(xì)胞術(shù)也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用能更大程度地促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。結(jié)論Survivin RNAi和PsL 5F聯(lián)合作用，可顯著提高對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用和對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，這為腫瘤的綜合治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗室依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】Survivin；RNA干擾；半邊旗提取物5F；MCF-7細(xì)胞

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:004～006)

乳腺癌發(fā)病率在全球一直位居女性腫瘤首位，且還在遞增。Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的，屬IAP基因家族，高表達(dá)于很多常見腫瘤[1-2]，而瘤旁組織和成熟分化組織并不表達(dá)。因此，若能抑制Survivin 表達(dá)則可能有助于乳腺癌等的治療。半邊旗，系鳳尾蕨科植物，為南方常用生藥之一，有止血、生肌、解毒、消腫之功效[3]。梁念慈等從其干燥全草中分離出幾種二萜類化合物，并證明包括5F在內(nèi)至少有3種二萜類成分具有很高的抗腫瘤活性[4-6]。他們的研究表明PsL 5F主要是通過線粒體途徑誘導(dǎo)包括HO-8910PM、HL-60、BLE-7402、A549和K562等癌細(xì)胞凋亡[7-8]。然而，PsL 5F具體的抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

1材料與方法

1.1　材料

MCF-7細(xì)胞株購自上海拜力生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，GENMED腺病毒純化試劑盒購自展晨生物有限公司，MTT購自Sigma公司，Survivin一抗購自SantaCruze公司，PsL 5F藥物由廣東醫(yī)學(xué)院天然藥物開發(fā)中心梁念慈教授惠贈(純度為98%)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞及其培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞株培養(yǎng)于100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，并按16 U/100 ml 加入精制胰島素培養(yǎng)，37 ℃、5%二氧化碳孵箱。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長匯合達(dá)90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2重組腺病毒Ad-Survivin滴度和感染效率的測定取13 μl病毒液，按1∶75稀釋于10 mM Tris-Cl中，用該稀釋液調(diào)零測波長260 nm時的吸光度值，重復(fù)測量3次。取平均值代入公式：病毒滴度=A260×75×1012(pt/ml)計算。采用β-gal染色法檢測病毒的感染效率。

1.2.3PsL 5F藥物的配制PsL 5F藥物粉末用DMSO 配制成10 mg/ml，分裝凍存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。處理細(xì)胞時DMSO最終濃度<0.1%。

1.2.4MTT實驗消化MCF-7細(xì)胞并調(diào)整濃度為1×105/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，常規(guī)條件下過夜；按組給予0、6.25、12.5、25、50、100和200 μM的PsL 5F，每組設(shè)3個復(fù)孔；24 h或48 h后每孔加入10 μl MTT (5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO溶解，用微量振蕩器搖振15 min，測定吸光度(A)；實驗重復(fù)3次。據(jù)公式計算抑制率并獲得藥物IC50，計算公式：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-給藥組細(xì)胞A值/對照組細(xì)胞A值 )×100%。

1.2.5Ad-Survivin聯(lián)合PsL 5F對細(xì)胞的作用同上方法接種細(xì)胞于96孔板。細(xì)胞貼壁后分別給予PBS、Ad-Survivin(MOI=100)、PsL 5F(終濃度為IC50)和Ad-Survivin(MOI=100)聯(lián)合PsL 5F(終濃度為IC50)，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別于24 h、48 h和72 h采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.6免疫印跡檢測Survivin蛋白接種細(xì)胞于6孔板，1×106/孔。細(xì)胞貼壁后分別給予PBS、Ad-Survivin(MOI=100)、PsL 5F(終濃度為IC50)和Ad-Survivin聯(lián)合PsL 5F。作用48 h提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入第1 抗體于室溫孵育2 h，用TBST 緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入第2抗體于室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入發(fā)光試劑(ECL) 顯色，X光片曝光。

1.2.7Annixin V-FITC和PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡處理后48 h，胰酶消化(避免過度消化)至細(xì)胞將要脫壁，去除消化液；輕輕將細(xì)胞吹下，轉(zhuǎn)移至離心管，1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，盡量去凈上清，PBS輕輕重懸細(xì)胞計數(shù)；取5萬-10萬重懸細(xì)胞，1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清，加195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫避光孵育10 min；1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清，加190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入10 μl PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置；立即FCM檢測。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料均采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素ANOVA。

2結(jié)果

2.1　重組腺病毒Ad-Survivin滴度和感染效率的測定

測波長260 nm時的吸光度值，重復(fù)測量3次，取平均值代入公式獲得病毒滴度為1.2×1011pt/ml。β-gal染色后可見病毒感染24 h后約80%被感染，而病毒感染48 h后幾乎所有的細(xì)胞被感染。

2.2　PsL 5F對細(xì)胞的增殖抑制情況

分別用0～200 μM的PsL 5F作用MCF-7細(xì)胞24 h后，MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率，計算得IC50≈110 μM。結(jié)果表明PsL 5F能明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖(6.25、12.5、25、50、100和200 μM相當(dāng)于對照組的P值分別為0.001、<0.001、0.020、<0.001、<0.001、<0.001)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。

圖1　PsL 5F對MCF-7細(xì)胞增殖抑制情況

2.3　Survivin表達(dá)情況

Ad-Survivin作用MCF-7細(xì)胞48 h后，蛋白質(zhì)印跡實驗發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白的表達(dá)明顯被抑制(圖2)，表明重組腺病毒介導(dǎo)Survivin RNAi發(fā)揮了作用。

圖2　Survivin蛋白表達(dá)的沉默情況

2.4　Ad-Survivin聯(lián)合PsL 5F對細(xì)胞的作用

PsL 5F(110 μM)聯(lián)合Ad-Survivin作用MCF-7細(xì)胞48 h，MTT實驗發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用Ad-Survivin對細(xì)胞增殖的抑制率為52.00%，單獨(dú)應(yīng)用PsL 5F為60.00%，然而聯(lián)合應(yīng)用則可提高到86.12%(P<0.001)。

2.5　流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

單獨(dú)應(yīng)用PsL5F和Ad-Survivin，早期和晚期凋亡細(xì)胞總數(shù)分別為19.06%和27.20%，而聯(lián)合應(yīng)用則可提高至32.50%，且以晚期凋亡細(xì)胞為主。

3　討論

腫瘤是多因素、多基因、多階段綜合作用的的結(jié)果[9]。目前，化療作為治療惡性腫瘤的三大常規(guī)手段之一，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療。然而由于其不能有效地靶向腫瘤細(xì)胞，故在發(fā)揮抗癌作用的同時帶來了一系列毒副反應(yīng)，而且容易產(chǎn)生耐藥性和死灰復(fù)燃的現(xiàn)象。于是，人們想到基因治療的方法，將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)此基因而獲得特定的功能，繼而執(zhí)行或介導(dǎo)對腫瘤的殺傷和抑制作用。尤其近來RNAi技術(shù)的出現(xiàn)更為腫瘤的基因治療注入新鮮的活力[10-11]。目前已有很多針對Bcl-2 、survivin、EGFR、VEGF等基因的RNAi在體內(nèi)外有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的生長[12-14]。然而，雖然目前腫瘤的基因治療研究可謂是如火如荼，但是作為腫瘤的治療手段仍不成熟，比如基因的導(dǎo)入方法等尚需進(jìn)一步完善。因此，在研究腫瘤基因治療的同時，還應(yīng)該發(fā)展基因治療與化療、與中醫(yī)藥治療及其他生物治療相結(jié)合的綜合治療。鑒于此，本研究以天然藥物半邊旗提取物5F(PsL 5F)和凋亡抑制基因Survivin為研究對象，以Survivin高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究模型，采用重組腺病毒介導(dǎo)的RNAi方法聯(lián)合PsL 5F作用進(jìn)行一種治療綜合治療的體外研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用PsL 5F和RNAi方法，對細(xì)胞的增殖抑制率分別為60%和52%，而聯(lián)合應(yīng)用則可提高到80%(P<0.05)。細(xì)胞凋亡檢測實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡指數(shù)從19.06%和27.20%提高至32.5%。綜上所述，本研究采用Survivin RNAi和PsL 5F聯(lián)合作用的方法，可顯著提高對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用和對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，這為減少腫瘤藥物用量和毒副作用提供有力的實驗室依據(jù)。

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(編輯：吳小紅)

The Effect of Survivin RNAi Combined with PsL 5F on the Proliferation and Apoptosis of MCF-7 Cell

LIUXuan,WANGRunxiu,WUXiaoyun,etal.GanzhouCancerHospital,Ganzhou,341000

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of gene therapy,mediated by RNAi combined with PsL 5F on the proliferation and apoptosis of tumor cells.MethodsAfter treated with Survivin RNAi combined with PsL 5F for 48 hours,Survivin was knockdowned by Western blot.The cell proliferation of MCF-7 cells were assayed by MTT,and the flow cytometry was used to detct the cell apoptosis.ResultsAfter 48 hours combined treatment,Survivin was significantly knockdowned,and the inhibitory rate on the proliferation of MCF-7 cells improved from about 50 percent(P<0.001)to 86.12 percent(P<0.001).And also the combined treatment could strongly promote cells apoptosis.ConclusionSurvivin RNAi joint PsL 5F could enhance the inhibition of MCF-7 cell proliferation and promote cell apoptosis,and it could provide laboratory evidence for reducing dosage and side effects of cancer chemotherapy drugs.

【Key words】Survivin;RNA interference;PsL 5F;MCF-7 cells

中圖分類號：R73-36

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0004-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.002

通訊作者：謝富華

基金項目：作者單位:341000 贛州市腫瘤醫(yī)院(劉軒)；341000 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(王潤秀)；341000 贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(吳小云)；341000 贛南醫(yī)學(xué)院分析與檢測實驗教學(xué)中心(謝富華)

收稿日期(2015-02-10修回日期 2015-06-05)