陳　華　陳淑霞　袁　靜　王立立　呂妍琨　杜榮品　谷　劍　李　燕

(河北省人民醫(yī)院心臟中心，河北　石家莊　050051)

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鹽酸法舒地爾對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織Toll樣受體/MyD88信號(hào)通路的影響

陳華陳淑霞袁靜王立立呂妍琨杜榮品谷劍李燕1

(河北省人民醫(yī)院心臟中心，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的探討鹽酸法舒地爾對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌組織Toll樣受體(TLR)/MyD88信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。方法采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立CHF大鼠模型，分為健康對(duì)照組、模型組、治療(鹽酸法舒地爾)組和地高辛組，給予相應(yīng)藥物干預(yù)4 w后，觀察大鼠心臟功能指標(biāo)，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Western印跡法分別檢測(cè)各組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果模型組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.01)。同時(shí)，模型組心功能指標(biāo)左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室重量指數(shù)(LVMI)與對(duì)照組相比明顯增高(P<0.01)，而左心室內(nèi)壓最大上升、下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)則顯著降低(P<0.01)。治療組干預(yù)后，無(wú)論是在mRNA還是在蛋白表達(dá)水平，心肌組織TLR2、TLR4和MyD88表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)，同時(shí)可明顯改善心臟功能指標(biāo)(P<0.01)。結(jié)論鹽酸法舒地爾可能通過(guò)下調(diào)CHF大鼠心肌組織TLR2、TLR4和MyD88表達(dá)水平，抑制TLR/MyD88信號(hào)通路來(lái)改善CHF癥狀。

關(guān)鍵詞〔〕慢性心力衰竭；鹽酸法舒地爾；TLR/MyD88信號(hào)通路

1河北省人民醫(yī)院血液科

第一作者：陳華(1980-),女,碩士，主治醫(yī)師,主要從事心血管病研究。

慢性心力衰竭(CHF)是大部分心血管疾病終末階段所表現(xiàn)出的一種常見的復(fù)雜臨床癥狀群，以肺循環(huán)和體循環(huán)淤血為主要特征。其發(fā)病率、致殘率和致死率均較高，病情復(fù)雜，總體預(yù)后差，并且需較高的醫(yī)療支出，嚴(yán)重威脅患者的健康〔1〕。CHF患者的神經(jīng)激素系統(tǒng)活性、炎性細(xì)胞因子水平及氧化應(yīng)激作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)剪切力降低導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)皮舒縮功能障礙〔2〕。血管內(nèi)皮功能障礙反過(guò)來(lái)增加冠狀動(dòng)脈阻力，降低血流量和血管順應(yīng)性，外周血管過(guò)度擴(kuò)張易增加心臟后負(fù)荷，導(dǎo)致心肌缺血加重，形成惡性循環(huán)從而加重心力衰竭，提示內(nèi)皮功能是CHF防治的潛在靶點(diǎn)〔3〕。鹽酸法舒地爾是一種新型的小分子G蛋白(Rho)激酶抑制物，研究證實(shí)了鹽酸法舒地爾可防止缺血再灌注損傷，改善腦組織微循環(huán)，減少心肌細(xì)胞凋亡，擴(kuò)張血管，同時(shí)可降低內(nèi)皮細(xì)胞的張力、降低血液黏滯性和血栓形成及拮抗炎性因子〔4〕。本研究觀察鹽酸法舒地爾對(duì)CHF大鼠心肌組織Toll樣受體(TLR)/MyD88信號(hào)通路的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料6～8 w齡健康雄性SD大鼠60只，平均體質(zhì)量(200±20)g，清潔級(jí)，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)1 w后開始實(shí)驗(yàn)。鹽酸法舒地爾(2 ml：30 mg)購(gòu)自山西普德藥業(yè)股份有限公司，地高辛片(0.25 mg/片)購(gòu)自賽諾菲(杭州)制藥有限公司，抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDA-PAGE)電泳槽、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司)。

1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI Genbank上已公布的大鼠TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH基因的mRNA序列及相關(guān)參考文獻(xiàn)合成TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH的定量PCR引物〔5〕，序列見表1，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　RT-PCR引物序列

1.3模型建立及動(dòng)物分組采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立CHF大鼠模型。1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射大鼠，麻醉后于胸骨左側(cè)4～5肋間找到心尖搏動(dòng)最明顯處作橫向切口，剪開皮膚鈍性分離肌層后找到心臟，用眼科鑷和直剪剪開心包膜，然后將心臟底面翻轉(zhuǎn)，在離左冠狀動(dòng)脈前降支2 mm處用6/0號(hào)手術(shù)縫合線將冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，利用生理記錄儀觀察心電圖，心肌梗死模型建立的標(biāo)準(zhǔn)為心電圖顯示ST段弓背向上抬高，術(shù)后青霉素預(yù)防傷口感染。4 w后行心臟超聲檢查及血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，以射血分?jǐn)?shù)(EF)值降至60%以下大鼠為標(biāo)準(zhǔn)入選心力衰竭組。60只大鼠隨機(jī)挑出10只作為對(duì)照組，剩余50只大鼠用于造模，將造模成功的大鼠按數(shù)字隨機(jī)分為3組：模型組、治療組(鹽酸法舒地爾5 mg/kg)和地高辛組(0.25 mg/kg)，對(duì)照組和模型組每日經(jīng)胃管喂養(yǎng)相同劑量生理鹽水作為安慰劑，每日兩次用藥，連續(xù)飼養(yǎng)4 w，記錄造模大鼠死亡情況，所有大鼠均統(tǒng)一飼養(yǎng)，觀察所有大鼠情況，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間自由飲水進(jìn)食。

1.4心功能指標(biāo)測(cè)定藥物干預(yù)4 w后3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在大鼠頸前正中作切口，于右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，然后將多媒體生物信號(hào)記錄儀系統(tǒng)連接至另一端以檢測(cè)大鼠心功能。檢測(cè)指標(biāo)為包括左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。同時(shí)，取出左心室稱重，計(jì)算左心室重量指數(shù)(LVMI)，即LVMI=大鼠左心室重量/大鼠體重。

1.5RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR將心肌組織50 mg剪碎置于組織研磨缽中，加入2 ml Trizol和適量液氮后反復(fù)充分研磨，室溫靜置5 min。將液體轉(zhuǎn)移至1.5 ml無(wú)RNA酶的EP管中，加入0.2 ml氯仿后劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min。14 000 r/min 4℃離心10 min，離心后分上中下三層，上層水相為RNA。小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 ml無(wú)RNA酶的新EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒數(shù)次充分混勻，室溫靜置10 min。14 000 r/min 4℃離心10 min，小心棄去上清液，加入1 ml 焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制的75%乙醇輕微洗滌沉淀，不宜振蕩，14 000 r/min 4℃離心10 min。小心棄去上清液，將EP管放于超凈臺(tái)，風(fēng)干沉淀，用20 μl無(wú)RNA酶的ddH2O溶解即得到總RNA。利用DNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提及異丙醇沉淀純化RNA。按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得mRNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說(shuō)明書配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，于熒光定量PCR儀進(jìn)行樣本的PCR擴(kuò)增，各基因mRNA表達(dá)水平通過(guò)2-ΔCt表示。

1.6蛋白提取與Western印跡測(cè)定用含有0.1% PMSF的預(yù)冷生理鹽水沖洗心肌組織，取100 mg組織加入400 μl RIPA裂解液后于組織研磨器上研磨，然后冰上靜置30 min，10 000 r/min 4℃離心30 min，去上清液，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配置12%下層分離膠和5%上層濃縮膠，取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液沸水中孵育10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后切下目的蛋白凝膠于轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后的膜用含有5%脫脂奶粉的吐溫-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)封閉液封閉，一抗兔抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗體孵育過(guò)夜，TBST液洗膜后加入二抗結(jié)合1 h，沖洗后利用ECL發(fā)光試劑盒顯影，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1一般情況采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法共造模50只，未出現(xiàn)麻醉過(guò)量而引起大鼠死亡，但術(shù)中有13只出現(xiàn)失血過(guò)多、心臟穿孔和心肌梗死等引起的死亡，術(shù)中死亡率為26%。術(shù)后4 w內(nèi)有5只大鼠由于心肌梗死過(guò)重失代償陸續(xù)死亡，且全部發(fā)生在術(shù)后2 w內(nèi)，術(shù)后死亡率為13.52%。術(shù)后4 w后尚成活32只，手術(shù)成活率為64%，按數(shù)字隨機(jī)分成3組：模型組(n=11)、治療組(n=11)和地高辛組(n=10)，在隨后的實(shí)驗(yàn)干預(yù)中并未見有大鼠出現(xiàn)死亡。CHF造模后大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差及張口呼吸、乏力等心力衰竭癥狀，并且術(shù)后體重與對(duì)照組相比明顯下降(P<0.01)，術(shù)后4 w內(nèi)雖有所回升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組和地高辛組干預(yù)后體重逐漸恢復(fù)，明顯高于模型組(P<0.01)，但治療組和地高辛組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2各組心功能比較與對(duì)照組相比，其他3組LVSP、LVEDP和LVMI明顯增高(P<0.01)，而+dp/dtmax和-dp/dtmax則顯著降低(P<0.01)。治療組和地高辛組治療后各項(xiàng)心功能與模型組均有明顯改善(P<0.01)，但治療組和地高辛組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3各組心肌TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，其他3組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)。藥物干預(yù)后，治療組和地高辛組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，但表達(dá)量仍明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)治療組和地高辛組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)量差異不顯著。見表2。

2.4各組心肌TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組中TLR2、TLR4和MyD88蛋白均有所表達(dá)，TLR4表達(dá)量最弱，模型組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，而治療組治療后蛋白表達(dá)水平有所降低，這與地高辛組一樣。見圖1。

表2　各組大鼠心功能情況及TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)比較

與對(duì)照組相比:1)P<0.01；與模型組相比:2)P<0.01

圖1　各組TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)比較

3討論

有學(xué)者提出通過(guò)膳食調(diào)理改善營(yíng)養(yǎng)水平有助于預(yù)防CHF的發(fā)生，并且一度被認(rèn)為是最有吸引力的策略之一。但CHF是一種神經(jīng)-體液和炎癥性綜合征，CHF的發(fā)生和發(fā)展涉及多種分子和細(xì)胞復(fù)雜機(jī)制的參與。簡(jiǎn)單地改善飲食結(jié)構(gòu)并不能達(dá)到理想結(jié)果。傳統(tǒng)藥物治療如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑等雖然可減輕CHF癥狀，增加運(yùn)動(dòng)耐力，可適當(dāng)提高患者生存率，但患者預(yù)后和生活質(zhì)量往往較差，仍需進(jìn)一步改善〔6〕。血管內(nèi)皮舒縮功能障礙和心臟收縮的生理調(diào)節(jié)異常在CHF發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用〔7〕。RhoA位于Gq下游，是一種低分子量的GTP酶，該蛋白具有參與心肌重塑的功能〔8〕。因此，改善心肌收縮功能是CHF防治的潛在靶標(biāo)。

目前已研究的Rho激酶抑制劑藥物較多，且更新?lián)Q代較快，鹽酸法舒地爾作為新型神經(jīng)保護(hù)劑已在臨床應(yīng)用中取得顯著效果。鹽酸法舒地爾是5-異喹啉磺酰胺衍生物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，早期主要應(yīng)用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣，而隨后研究證實(shí)了它能有效擴(kuò)張血管、保護(hù)缺血腦組織〔9〕。鹽酸法舒地爾通過(guò)進(jìn)入肌細(xì)胞與ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)而阻斷Rho激酶的活性，通過(guò)調(diào)控肌球蛋白結(jié)合亞基磷酸化水平途徑參與心肌細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)。同時(shí)，鹽酸法舒地爾還具有降低心室肥厚指數(shù)和心室壁張力及提高心室肌彈性和順應(yīng)性、改善血流動(dòng)力學(xué)的功能。劉克強(qiáng)〔10〕指出，冠心病心力衰竭患者在給予利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑和硝酸酯治療的基礎(chǔ)上靜脈滴注含有法舒地爾注射液的葡萄糖，每月1個(gè)療程，連用3個(gè)月，治療后未發(fā)現(xiàn)患者有明顯不良反應(yīng)，且治療前后各項(xiàng)生化指標(biāo)無(wú)明顯變化，同時(shí)可明顯提高左心室EF及降低左心室收縮末容量和舒張末容量。臨床效果分析顯示，鹽酸法舒地爾可顯著改善冠心病心力衰竭臨床癥狀，總有效率達(dá)到89.3%。

近來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，TLR2基因缺陷小鼠經(jīng)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造模后死亡率和左心室功能不良發(fā)生率明顯低于正常的小鼠〔11〕，而TLR4基因缺陷的小鼠對(duì)燒傷后引起的心力衰竭發(fā)生率明顯降低〔12〕。同時(shí)臨床研究也發(fā)現(xiàn)老年CHF患者外周血單核細(xì)胞表面的TLR2/4表達(dá)水平顯著上調(diào)〔13〕。這些研究表明TLR2/4的表達(dá)顯著上調(diào)可能是促進(jìn)CHF的發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一。

綜上，可以推斷抑制TLR/MyD88信號(hào)通路可能是鹽酸法舒地爾防治CHF的作用機(jī)制之一。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯苑云杰)

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文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0055-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.024