賓冬梅,黃河清濤,楊 燦,易 誠(chéng),伍渡清,饒力群

(1.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.燕京啤酒(衡陽(yáng))有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421008)

基于啤酒酵母二次發(fā)酵啤酒糟條件響應(yīng)面優(yōu)化研究

賓冬梅1,黃河清濤2,楊 燦1,易 誠(chéng)1,伍渡清3,饒力群2

(1.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.燕京啤酒(衡陽(yáng))有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421008)

為提高發(fā)酵啤酒糟高蛋白產(chǎn)量，以一次發(fā)酵的黑曲霉和木霉雙菌發(fā)酵的啤酒糟為原料，以粗蛋白含量為指標(biāo)，以枯草芽孢桿菌分別與啤酒酵母配伍進(jìn)行二次混菌發(fā)酵，并利用響應(yīng)面進(jìn)行分析優(yōu)化，結(jié)果表明：啤酒酵母和枯草芽孢桿菌二次發(fā)酵啤酒糟對(duì)應(yīng)的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發(fā)酵時(shí)間4天，理論粗蛋白質(zhì)含量38.11 %。

啤酒糟；混菌；二次發(fā)酵；響應(yīng)面；高蛋白

啤酒糟是啤酒生產(chǎn)的殘留物質(zhì)，主要含有纖維素、淀粉及蛋白質(zhì)[1]等，因含有大量水分則容易產(chǎn)生變質(zhì)。目前啤酒企業(yè)絕大部分作為粗飼料銷售，而因?yàn)槔w維含量過高、適口性差，不能完全被養(yǎng)殖戶接收[2-5]，很多企業(yè)當(dāng)作廢棄物處置，既浪費(fèi)了資源，還污染了環(huán)境[6]。為了能夠更高效利用啤酒糟，優(yōu)選出產(chǎn)生纖維素酶的最佳發(fā)酵配伍方案，選定發(fā)酵菌種。

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶的菌種主要有木霉、曲酶等[7-11]，全球纖維素酶市場(chǎng)中的20 %是來自曲霉屬和木霉屬[12]。本文以一次發(fā)酵的黑曲霉和木霉雙菌發(fā)酵，以料水比為1∶0.5，黑曲霉比木霉接種量為5∶5的混菌接種20 %，32 ℃下培養(yǎng)3天的啤酒糟為原料，以粗蛋白含量為考察指標(biāo)，使用啤酒酵母菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到啤酒糟第二次發(fā)酵的最佳工藝，生產(chǎn)蛋白啤酒糟飼料，達(dá)到立體開發(fā)啤酒糟的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料

新鮮啤酒糟(燕京啤酒(衡陽(yáng))有限公司提供)

1.1.2 菌種

啤酒酵母NO.1(Sac-charomyces cerevisiae)和枯草芽孢桿菌NO.1(Bacillus subtilis)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面(平板)培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：酵母菌使用麥芽汁培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1 L蒸餾水+20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+5 g氯化鈉+0.5 g牛肉膏+20 g瓊脂)；發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒槽與麩皮的比例為8∶2。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、蛋白胨、瓊脂、硫酸銅、尿素、無水乙醇，均為分析純。

1.1.5 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫水槽、紫外-可見分光光度計(jì)、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水浴鍋、凱氏定氮儀、冷凍高速離心機(jī)、粗纖維測(cè)定儀、恒溫培養(yǎng)搖床、超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、高壓滅菌器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

斜面孢子的培養(yǎng)：將菌株轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面試管，于30 ℃培養(yǎng)3 d。

種子制備：往250 mL三角瓶中倒入150 mL種子培養(yǎng)基，設(shè)置115 ℃滅菌16 min，等待冷卻后接入新鮮成熟菌種斜面孢子一環(huán)，在搖床中30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：取發(fā)酵培養(yǎng)基30 g加入到250 mL的燒杯中，在115 ℃滅菌15 min后，培養(yǎng)條件為含水量2倍，混菌接種20 %，其中黑曲霉比木霉接種量為6∶4，在30 ℃下培養(yǎng)3 d后，再接種一定量酵母菌和枯草芽孢桿菌，在一定溫度下培養(yǎng)若干天。

1.2.2 蛋白質(zhì)測(cè)定

粗蛋白含量的檢測(cè)，使用飼料中粗蛋白的測(cè)定方法(GB/T 6432-94)

稱0.5-1 g試樣，放入到250 mL玻璃容器中，加入蒸餾水50 mL后，煮沸30 min。再加入10 %硫酸銅溶液和2.5 %氫氧化鈉溶液各20 mL，并不停攪拌。靜置2 h后定量濾紙過濾。沉淀用70 ℃的熱水進(jìn)行洗滌。最后沉淀在65 ℃烘干2 h。再把沉淀物放入到消化管中，加入混合催化劑6.4 g，硫酸12 mL，在420 ℃的消化爐上消化1 h。取出等待冷卻后加入30 mL蒸餾水。

將帶有消化液的管子插入蒸餾裝置，其末端要浸入錐形瓶的吸收液內(nèi)，吸收液用25 mL硼酸，加入2滴混合指示劑，消煮管中加入50 mL氫氧化鈉溶液蒸餾至吸收液體積達(dá)到100 mL，取出錐形瓶，冷凝管末端的蒸餾水沖洗液需要流入錐形瓶?jī)?nèi)。

吸收液的滴定：0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色。

稱0.5 g蔗糖代替試樣進(jìn)行空白測(cè)定，消耗滴定液(0.1 mol/L鹽酸)的體積不能超過0.2 mL。

計(jì)算公式：

粗蛋白質(zhì)

其中V2—滴定試樣所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL；V1—滴定空白所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL；C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m—試樣質(zhì)量，g；V—試樣分解液總體積，mL；V3—試樣分解液蒸餾用體積，mL；0.0140—每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；6.25—換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法

Plackett-Burman設(shè)計(jì)：在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇可能對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響因素，包括菌種比、硫酸銨、時(shí)間、尿素、接種量、溫度。為了對(duì)這6個(gè)因素進(jìn)行全面考察，以粗蛋白質(zhì)含量作為響應(yīng)值Y，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，察各因素的主效應(yīng)和交互作用(見表1)。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選主要的發(fā)酵影響因素

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果

各因素系數(shù)估計(jì)和效應(yīng)評(píng)價(jià)見表3。

表3 各因素影響的主效應(yīng)分析

從表中可以看出，影響粗蛋白質(zhì)含量的主要因子是溫度、硫酸銨、接種量，三者在α=0.05水平上，P<0.05，表明對(duì)釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵啤酒糟的粗蛋白質(zhì)含量有顯著影響(置信度>95%，)，其他因素在α=0.05水平上，P>0.05，表明對(duì)產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量影響不顯著。所以以溫度、硫酸銨、接種量進(jìn)入下一步的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

2.1.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析：根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選的溫度、硫酸銨、接種量3個(gè)主要影響因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，各因素的取值水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 主要影響因素及水平

表5 主要影響因素及水平

2.1.3 回歸方程的方差分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，利用 Minitab軟件進(jìn)行各因素回歸擬合后得到回歸方程，方差分析見表6。

表6 回歸方程各項(xiàng)的方差分析

續(xù)表

來源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFP溫度*溫度11.0306.0066.0061.110.340接種量*接種量1295.889301.602301.60255.850.001硫酸銨*硫酸銨17.9027.9027.9021.460.280交互作用327.07027.0709.0231.670.287溫度*接種量18.2378.2378.2371.530.272溫度*硫酸銨14.2034.2034.2030.780.418接種量*硫酸銨114.63114.63114.6312.710.161殘差誤差527.00227.0025.400失擬326.78626.7868.92982.960.012純誤差20.2150.2150.108合計(jì)14542.470

2.1.4 響應(yīng)面直觀分析

RSA方法的圖形是接種量、硫酸銨量、溫度對(duì)應(yīng)特定的響應(yīng)值Y構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維面上的等高圖，能夠直觀反映三因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從得到的應(yīng)面分析圖(圖1)上可以找到接種量、硫酸銨量、溫度在發(fā)酵過程中的相互作用，確認(rèn)合適的工藝條件。

選用實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到的平均粗蛋白含量為37.46 %，與理論值相差小于1 %，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。其對(duì)應(yīng)的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發(fā)酵時(shí)間4 d，理論粗蛋白質(zhì)含量38.11 %。

圖1 接種量、硫酸銨添加量和溫度對(duì)啤酒糟發(fā)酵產(chǎn)蛋白含量影響的響應(yīng)面

2.5 各影響因素分析

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

在第二次發(fā)酵中，使培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量增高的是酵母菌的增殖，在前期發(fā)酵中，酵母菌以木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類作為碳源，進(jìn)行孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)；隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，培養(yǎng)基中木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類逐漸減少，同時(shí)隨著酵母菌體生物量逐漸增加，在發(fā)酵后期由于菌種的老化，反而會(huì)影響啤酒糟中的蛋白質(zhì)含量。

2.5.2 菌液的接種量對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

顯然，接種量會(huì)直接影響產(chǎn)酶結(jié)果，接種量過少，菌種生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng)，糖原的消耗增加，后期供酵母發(fā)酵的糖原不足，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低； 接種量過多，前期糖原消耗急劇增加，會(huì)導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求。

2.5.3 溫度對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

溫度是微生物生長(zhǎng)的最重要的影響因素之一。各種菌種都有其最相適宜的生長(zhǎng)溫度。在 0 ℃以下，菌體生長(zhǎng)緩慢甚至處于休眠狀態(tài)，溫度過高可能使其生長(zhǎng)繁殖受抑制甚至死亡。混菌發(fā)酵中存在多種菌種，每種菌生長(zhǎng)發(fā)酵的適宜溫度又不盡相同。選擇合適的溫度，使各菌種之間互相補(bǔ)充互相促進(jìn)，既有利于代謝產(chǎn)物的大量累積，又不會(huì)影響微生物自身的生長(zhǎng)代謝。但發(fā)酵溫度過高，易造成雜菌的感染而影響發(fā)酵。

2.5.4 硫酸銨的添加量對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

微生物生長(zhǎng)需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要的有碳源、氮源、無機(jī)鹽、水分等。從實(shí)驗(yàn)來看，酵母菌以木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類作為碳源，能滿足酵母及枯草芽孢桿菌的孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)及發(fā)酵的需要，而氮原明顯不足，因此添加的硫酸銨氮源對(duì)發(fā)酵具有顯著的影響。

3 結(jié) 論

在以黑曲霉和木霉雙菌一次發(fā)酵的啤酒糟中，添加啤酒酵母與枯草芽孢桿菌進(jìn)行二次混菌發(fā)酵，并利用響應(yīng)面進(jìn)行發(fā)酵條件分析優(yōu)化，結(jié)果表明：啤酒酵母和枯草芽孢桿菌二次發(fā)酵啤酒糟對(duì)應(yīng)的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發(fā)酵時(shí)間4 d，理論粗蛋白質(zhì)含量38.11 %，表明通過二次混菌發(fā)酵能顯著提高啤酒糟粗蛋白含量。

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(編校 陳志陽(yáng))

On Optimization of Second Fermentation of Brewer's Grains Through Response Surface Based onBeerYeast

BINDong-mei1,HUANGHe-qing-tao2,YANGCan1,YICheng1,WUDu-qing3,RAOLi-qun2

(1.College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang Hunan 421008,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha Hunan 410128,China;3.Yanjing(Hengyang) Beer Co.Ltd,Hengyang Hunan 421008,China)

In order to improve the output with high protein in Brewer's Grains with fermentation,take the Brewer's Grains as raw materials which through first fermentation withAspergillusandTrichoderma,the crude protein content as the index,secondary fermentation with mixedBacillussubtilisandBeerYeast,and optimized the craftwork with response surface analysis.Results show that: the secondary fermentation withbeeryeastandBacillussubtilisin optimum conditions which temperature was 35 ℃,inoculum was 16.26 %,beeryeastandBacillussubtilisinoculation ratio was 5:1,ammonium sulfate was 3.46 %,urea content was 2 %,fermentation time was 4 days,the theory crude protein content was 38.11 %.

brewer's grains; mixed microorganism; secondary fermentation; response surface analysis; high protein

2016-10-09

湖南省自然科學(xué)基金省市聯(lián)合基金(14JJ5001)

賓冬梅(1970-)，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)與利用。

Q936

A

1673-0313(2016)06-0101-05