劉辰庚　孟　雙　張躍其　王培昌

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京　100053)

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microRNA-135a在阿爾茨海默病患者中的檢測價(jià)值

劉辰庚孟雙1張躍其王培昌

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100053)

摘要〔〕目的初步探討microRNA-135a(miR-135a)作為阿爾茨海默病(AD)生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。方法使用實(shí)時定量PCR檢測癡呆期AD(DAT)患者、輕度認(rèn)知障礙(MCI)患者和表面健康受試者血清和腦脊液中miR-135a含量。結(jié)果MCI和DAT患者血清miR-135a水平均低于對照組(P<0.05)，且DAT組低于MCI組(P<0.05)；MCI和DAT患者腦脊液總體miR-135a水平均低于對照組(P<0.05)，且DAT組低于MCI組(P<0.05)；且miR-135a對于早期AD的診斷價(jià)值可能優(yōu)于Aβ42。結(jié)論血清miR-135a可能為AD，特別是早期AD診斷的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默??；微小RNA；生物標(biāo)志物

1中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所

第一作者：劉辰庚(1980-)，男，博士，主管技師，主要從事衰老和相關(guān)疾病標(biāo)志物篩選研究。

目前對癡呆期阿爾茨海默病(AD)(DAT)患者缺乏有效的治療手段〔1〕。β淀粉樣蛋白(Aβ42)、p-tau等對輕度認(rèn)知障礙(MCI)和臨床前期AD患者的診斷陽性率并不令人滿意〔2,3〕。本文在前期研究的基礎(chǔ)上〔4〕，檢測分析MCI和DAT患者腦脊液(CSF)和血清中的microRNA(miR)-135a的變化，初步分析其作為AD早期診斷標(biāo)志物的價(jià)值。

1材料與方法

1.1臨床資料隨機(jī)選取2012年1月至2015年1月就診于宣武醫(yī)院的AD患者共162例，其中MCI 63例(男33例，年齡中位數(shù)61歲；女30例，中位年齡65歲)；DAT患者99例(男41例，中位年齡72歲；女58例，中位年齡76歲)。MCI和DAT均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5,6〕。分別針對MCI和DAT組隨機(jī)選取健康受試者各60例為對照組(MCI對照組：男30例，中位年齡61歲；女30例，中位年齡65歲。DAT對照組：男30例，中位年齡72歲；女30例，中位年齡76歲)。采集全部受試者的血液標(biāo)本和其中25例患者的CSF標(biāo)本(8例MCI：男性，中位年齡61歲。17例DAT：男8例，中位年齡70歲；女9例，中位年齡68歲)。CSF標(biāo)本的對照組選取無癡呆、腫瘤和感染性疾病且CSF生化、細(xì)菌、常規(guī)結(jié)果正常的標(biāo)本，并保證性別年齡匹配。本研究經(jīng)宣武醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集受試者空腹12 h后分別使用肝素抗凝管和促凝管采集靜脈血，抽血后1 h內(nèi)以3 000 r/min、7 min分離血漿或血清。抽血后1 h內(nèi)由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生按照相應(yīng)操作規(guī)程抽取CSF標(biāo)本2 ml。標(biāo)本在分析前保存于液氮中。

1.3小RNA提取及miR-135a測定使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR親和柱提取小RNA，按說明書操作。以提取小RNA前向標(biāo)本中加入的Ce_miR-39為內(nèi)參，使用2-△△CT法計(jì)算miR-135a水平〔7〕。

1.4內(nèi)參穩(wěn)定性試驗(yàn)將表面健康受試者的混合血清分為20份，每份標(biāo)本分別加入Ce_miR-39并分20次分別進(jìn)行小RNA提取和miR-135a檢測，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.5Aβ42檢測使用CUSABIO公司的ELISA試劑盒對CSF和血清標(biāo)本中的Aβ42進(jìn)行定量測定，按照說明書進(jìn)行操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用MedCalc V11和StatFlex V6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析資料是否呈正態(tài)分布;Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較不同年齡組間差異；Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較性別差異；相同患者不同標(biāo)本檢測組間比較使用配對t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的資料參考區(qū)間用(P2.5～P97.5)表示〔8〕。

2結(jié)果

2.1內(nèi)參穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)20份混合血清標(biāo)本miR-135a檢測結(jié)果的批間變異系數(shù)為9.15%。

2.2血液和CSF標(biāo)本miR-135a檢測同一受試者血清標(biāo)本(n=10，數(shù)據(jù)標(biāo)注化至1.00)中miR-135a略高于血漿(對照組分別為0.98、0.99、0.96、0.95；MCI組分別為0.94、0.99、0.96；DAT組0.97、0.99、0.97)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；血清和血漿標(biāo)本miR-135a相關(guān)系數(shù)(r2)為0.979。MCI(0.60±0.15)和DAT患者(0.41±0.11)血清miR-135a水平均低于對照組(0.86±0.19，P<0.05)，且DAT組低于MCI組(P<0.05)。MCI(0.73±0.19)和DAT患者(0.24±0.09)腦脊液總體miR-135a水平均低于對照組(1.00±0.25)(P<0.05)，且DAT組低于MCI組(P<0.05)。

2.3miR-135a與Aβ42檢測數(shù)據(jù)DAT患者腦脊液Aβ42(1.11±0.17)顯著低于MCI(1.93±0.21)和對照組(2.25±0.25)(P<0.05)，且MCI組低于對照組(P<0.05)。DAT患者血清和CSF miR-135a與CSF Aβ42的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.771和0.615，血清Aβ42與血清和CSF miR-135a均無相關(guān)性(P>0.05)。MCI患者血清和CSF miR-135a與CSF Aβ42的相關(guān)性略低，相關(guān)系數(shù)(r2 )分別為0.652和0.529，血清Aβ42與血清和CSF miR-135a均不具相關(guān)性(P>0.05)。表面健康受試者血清miR-135a水平呈偏態(tài)分布，同齡男女對照組和不同齡對照組的檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，故生物參考區(qū)間不需按性別年齡分組，為0.60～1.10。據(jù)此區(qū)間，本研究MCI受試者血清miR-135a的陽性率為63.5%(40/63)，DAT受試者為81.8%(81/99)，分別高于CSF Aβ42的40.3%和72.2%。

3討論

目前AD的臨床診斷主要依賴于神經(jīng)心理學(xué)評分和標(biāo)志物檢測。神經(jīng)心理學(xué)評分方法便捷、容易實(shí)施，但對癡呆前階段患者缺乏滿意的辨識率〔1～3,9〕；影像學(xué)標(biāo)志物如氟脫氧葡萄糖-PET成像、淀粉樣蛋白PET成像等對癡呆前階段診斷有較大幫助，但其技術(shù)復(fù)雜且動輒萬元的檢測費(fèi)用多數(shù)患者難以承受，故開展較少。體液標(biāo)志物具有檢測便捷、易于標(biāo)準(zhǔn)化、可組合檢測及價(jià)格相對低廉等特點(diǎn)，更加適用于早期篩查〔10〕。

目前被廣泛承認(rèn)的AD體液生物標(biāo)志物如Aβ、tau蛋白、p-tau蛋白等大都來源于CSF，檢測血液中的上述標(biāo)志物對其診斷意義不大〔10,11〕。對于AD特別是早期AD的檢測/篩查而言，尋找血液、尿液等較易獲取的標(biāo)本中的標(biāo)志物尤為重要；但目前研究較多的血液、尿液中的標(biāo)志物如血小板APP異構(gòu)體比值、載脂蛋白E、AD7c-NTP、同型半胱氨酸等的特異性和敏感性并不理想，僅能作為輔助指標(biāo)〔2,9～11〕。據(jù)此，2014年1月，來自多個國家的20余名專家聯(lián)名撰文呼吁〔12〕：研究者應(yīng)繼續(xù)著力尋找AD血液學(xué)標(biāo)志物。miR具有分子量小、在體液中能穩(wěn)定存在、可定量檢測等特性，是潛在的疾病標(biāo)志物，miR在AD診斷、特別是早期診斷中的價(jià)值已成為研究熱點(diǎn)。

miR是一類內(nèi)生的、長度約19～24個核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。我課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型海馬組織中miR-135a較野生型小鼠顯著下調(diào)〔4〕，且AD小鼠模型CSF和血清中的miR-135a亦顯著下調(diào)；目前并沒有藥物來對晚期AD進(jìn)行有效治療〔2,12〕。由于miR-135a相對BACE-1和Aβ42而言處于生物級聯(lián)作用的上游，故miR-135a可能對于AD的早期診斷有潛在幫助。這個猜想也在與Aβ42陽性率的橫向比較中得以印證-外周血miR-135a可能是較Aβ42更適宜的AD診斷，特別是早期診斷的標(biāo)志物。目前尚無直接證據(jù)表明miR能自由地通過血腦屏障，miR能存在于外吐小體和微囊泡中，并經(jīng)小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)而由CSF入外周血或由外周血入CSF。有人甚至認(rèn)為，細(xì)胞就是以外吐小體和微囊泡形式對外分泌miR〔13〕，這些外吐小體和微囊泡可能包含了分泌細(xì)胞要傳達(dá)給外界的信息。故作為在腦組織中高表達(dá)，在外周器官低表達(dá)的miR在外周血中含量的變化很可能是由腦組織向外周血對其釋放的多寡所導(dǎo)致。

參考文獻(xiàn)4

1Kirshner HS.Primary progressive aphasia and Alzheimer's disease:brief history,recent evidence 〔J〕.Curr Neurol Neurosci Rep,2012;12(6):709-14.

2Finder VH.Alzheimer's disease:a general introduction and pathomechanism〔J〕.J Alzheimers Dis,2010;30(Suppl 3):5-19.

3Galluzzi S,Geroldi C,Amicucci G,etal.Supporting evidence for using biomarkers in the diagnosis of MCI due to AD 〔J〕.J Neurol,2013;260(2):640-50.

4Liu CG,Wang JL,Li L,etal.MicroRNA-384 regulates both amyloid precursor protein and β-secretase expression and is a potential biomarker for Alzheimer's disease 〔J〕.Int J Mol Med,2014;34(1):160-6.

5賈建平,陸璐,張逸馳,等.美國國立老化研究所與阿爾茨海默病協(xié)會診斷指南寫作組:阿爾茨海默病源性輕度認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)推薦 〔J〕.中華神經(jīng)內(nèi)科雜志,2012;45(5):345-51.

6賈建平,陸璐,張逸馳,等譯.美國國立老化研究所與阿爾茨海默病協(xié)會診斷指南寫作組:阿爾茨海默病癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)的推薦〔J〕.中華神經(jīng)內(nèi)科雜志,2012;45(5):352-5.

7Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method 〔J〕.Methods,2001;25(4):402-8.

8王學(xué)晶,徐國賓,市原清志,等.北京、香港和中國臺灣地區(qū)成人血清肌酐參考區(qū)間的初步調(diào)查 〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志,2012;30(2):111-5.

9Yan R,Vassar R.Targeting the β secretase BACE1 for Alzheimer's disease therapy 〔J〕.Lancet Neurol,2014;13(3):319-29.

10Vos SJ,Xiong C,Visser PJ,etal.Preclinical Alzheimer's disease and its outcome:a longitudinal cohort study 〔J〕.Lancet Neurol,2013;12(10):957-65.

11Finder VH.Alzheimer's disease:a general introduction and pathomechanism 〔J〕.J Alzheimers Dis,2010;3:5-19.

12Snyder HM,Carrillo MC,Grodstein F,etal.Developing novel blood-based biomarkers for Alzheimer's disease 〔J〕.Alzheimers Dement,2014;10(1):109-14.

13Kooijmans SA,Vader P,van Dommelen SM,etal.Exosome mimetics:a novel class of drug delivery systems 〔J〕.Int J Nanomedicine,2012;7:1525-41.

〔2015-03-17修回〕

(編輯徐杰)

·其他·

The detection of microRNA-135a in the patients of Alzheimer′s disease

LIU Chen-Geng, MENG Shuang, ZHANG Yue-Qi,etal.

Clinical Laboratory of Xuanwu Hospital, Captital Medcial University, Beijing 100053, China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical value of microRNA-135a (miR-135a) in the detection of Alzheimer′s disease (AD).MethodsThe levels of miR-135a in mild cognitive impairment (MCI), dementia of Alzheimer′s type (DAT) and control group were tested.ResultsThe miR-135a levels in cerebro-spinal fluid from MCI and DAT were significantly higher than those of control (P<0.05), and it was lower in DAT group than that of MCI group(P<0.05). The miR-135a levels in serum from MCI and DAT were significantly lower than those of control(P<0.05), and it was lower in DAT group than that in MCI group(P<0.05). Furthermore, miR-135a might be a better marker than Aβ42 for early diagnosis of AD.ConclusionsThe serum miR-135a was a potential biomarker of AD, especially for its early stage.

【Key words】Alzheimer′s disease; micrnRNA; Biomarker

通訊作者：王培昌(1965-)，男，主任技師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事衰老和相關(guān)疾病機(jī)制研究及標(biāo)志物篩選研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金(No.81401734)；北京市醫(yī)院管理局“青苗”計(jì)劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(QML20150804)

中圖分類號〔〕R749〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0152-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.072