顧媛媛+張丹丹+馮程+王宇+陳大忠+王艷宏

[摘要]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，研究牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)大鼠與正常生理狀態(tài)大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)代謝的變化，篩選出與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)而分析其代謝通路，探討過(guò)敏反應(yīng)的代謝機(jī)制。采用牛血清白蛋白誘導(dǎo)大鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)為模型，檢測(cè)大鼠血清中組胺和類(lèi)胰蛋白酶的含量，對(duì)大鼠肺和氣管的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)過(guò)敏反應(yīng)模型組和空白對(duì)照組大鼠尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘辨別分析

（PLS-DA）的方法，觀察2組大鼠尿液的代謝輪廓差異，篩選出差異代謝物。模型組和對(duì)照組的代謝譜圖存在明顯差異，并篩選出與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的14個(gè)差異代謝物，4條主要代謝通路。該文建立了基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的大鼠尿液代謝組學(xué)研究方法，推測(cè)牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的作用機(jī)制可能涉及異黃酮、葉酸的生物合成，色氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝等過(guò)程，為進(jìn)一步探索代謝組學(xué)在藥物過(guò)敏反應(yīng)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]牛血清白蛋白； 生物標(biāo)志物； 代謝組學(xué)； 過(guò)敏反應(yīng)

[Abstract]The metabonomic techniques were used to study the changes in endogenous metabolites between urines of rats in normal physiological conditions and bovine serum albumin induced allergic reactions， identify potential biomarkers associated with allergic reactions， and then analyze the metabolic pathways and the metabolic mechanisms of allergic reactions. The bovine serum albumin-induced allergic reactions in rats were adopted as a model to detect histamine and tryptase in rat serum and observe the issue morphology of lungs and trachea in rats. UPLC-Q-TOF-MS was applied in metabonomic analysis on urines between control group and allergic reaction model group. Principal component analysis（PCA） and partial least squares discriminant analysis（PLS-DA） were applied to observe the differences in metabolic profiling between urines of the two groups and select differential metabolites. There were significant differences in metabolism spectrum between the model group and the control group. Totally 14 differential metabolites and 4 major metabolic pathways were screened out. The metabonomic research method for urines of rats with bovine serum albumin-induced allergic reactions based on UPLC-Q-TOF-MS was established in this study. It was speculated that the mechanism of bovine serum albumin-induced allergic reactions may involve biosynthesis of isoflavone and folic acid and metabolism of tryptophan， nicotinic acid and nicotinamide. It lays a foundation for further exploration of the application of metabolomics in drug allergy reaction studies.

[Key words]bovine serum albumin； biomarker； metabolomics； allergic reaction

doi：10.4268/cjcmm20162123

過(guò)敏反應(yīng)又稱(chēng)變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受同一抗原再次刺激后產(chǎn)生的一種異?；虿±硇悦庖叻磻?yīng)，主要表現(xiàn)為生理功能紊亂和組織損傷。過(guò)敏反應(yīng)是臨床常見(jiàn)的不良反應(yīng)，大多數(shù)藥物都有可能引起過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康，其危害不容忽視。隨著新藥涌現(xiàn)、藥物的不合理應(yīng)用等原因，藥物過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率一直居高不下。尤其是中藥注射劑在臨床的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)（ADR）報(bào)道也逐年增加，尤以過(guò)敏反應(yīng)事件較多。然而過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制并未完全明確^[1-3]。

代謝組學(xué)是一種后基因時(shí)代的全新組學(xué)技術(shù)，以生物體內(nèi)低相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的動(dòng)態(tài)規(guī)律變化。是從整體觀出發(fā)，以機(jī)體代謝組學(xué)變化為載體，以時(shí)空動(dòng)態(tài)性和全局性觀點(diǎn)，全面解析疾病對(duì)機(jī)體的影響^[4-6]。

本試驗(yàn)應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)，以牛血清白蛋白誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型為研究對(duì)象，分析過(guò)敏反應(yīng)引起的機(jī)體代謝狀態(tài)和內(nèi)源性小分子代謝物的變化，通過(guò)比較這些代謝物的變化情況，尋找與過(guò)敏反應(yīng)密切相關(guān)的生物標(biāo)記物和代謝通路，進(jìn)而探討過(guò)敏反應(yīng)的代謝機(jī)制，為中藥注射劑的臨床安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 美國(guó)Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀（包括四元梯度泵，在線(xiàn)真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱）；美國(guó)Micromass Q-TOF microTM四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（電噴霧離子源-正、負(fù)離子掃描方法-Lockspray）；色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；KDC-160 HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾中國(guó)上海儀器有限公司）；超低溫冰箱（Thermo）；KQ5200 E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JA 2003精密電子天平（上海良平儀器廠(chǎng)）。

牛血清白蛋白BSA（美國(guó)，Sigma公司）；0.9%氯化納注射液（中國(guó)浙江都邦藥業(yè)股份有限公司）；大鼠血清組胺檢測(cè)試劑盒（中國(guó)上海藍(lán)基生物科技有限公司）；胰蛋白（中國(guó)北京索萊寶科技有限公司）；色譜級(jí)乙腈（美國(guó)Fisher公司），屈臣氏蒸餾水（中國(guó)廣州屈臣氏食品有限公司），色譜級(jí)甲酸（中國(guó)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），亮氨酸-腦啡肽（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 動(dòng)物分組與造模 健康SD雄性大鼠（SPF級(jí)），體重（200±20） g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，動(dòng)物使用編號(hào)SYXK（黑）2013-012。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，且控制室內(nèi)溫度為（22±1） ℃、相對(duì)濕度40%～50%。12 h蔽光，12 h光照，自由飲水飲食，每只大鼠單獨(dú)代謝籠正常飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。

16只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型組，大鼠腹腔注射致敏，隔日1次，連續(xù)注射3次。于首次致敏后第14天和第21天對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射激發(fā)給藥，對(duì)照組給予同樣體積的0.9%氯化鈉注射液，即刻至30 min觀察大鼠出現(xiàn)的體征表現(xiàn)。每組給藥情況為空白對(duì)照組：致敏給予生理鹽水1.0 mL/只，激發(fā)給予生理鹽水2.0 mL/只；模型組：致敏給予0.6%的BSA，1.0 mL/只，激發(fā)給予2.4%的BSA，2.0 mL/只^[7-8]。

1.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 按大鼠Histamine ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠血清組胺含量。采用專(zhuān)屬性底物法檢測(cè)類(lèi)胰蛋白酶。

1.4 組織病理學(xué)檢查 于最后一次收集完尿液，將大鼠麻醉，取固定部位肺和氣管組織，置于4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水、透明、封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

1.5 樣本的預(yù)處理與UPLC-Q-TOF-MS分析條件^[9-11] 于每次給藥第2天7：00—8：00收集每只大鼠12 h內(nèi)的尿樣，13 000 r·min^-1（4 ℃）離心15 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)。第14天和第21天給藥激發(fā)后30 min于眼靜脈叢采血，室溫放置30 min，3 000 r·min^-1離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

色譜條件：ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水，梯度洗脫，0～8 min，2%～40% A，8～10 min，40%～98% A，10～13 min，98%～100% A；柱溫40 ℃；流速0.3 mL·min^-1。

質(zhì)譜條件：美國(guó)Micromass Q-TOF microTM四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，電噴霧電離源（ESI），采用正負(fù)離子掃描檢測(cè)；脫溶劑溫度為350 ℃，錐孔流速為20 L·h^-1；毛細(xì)管電壓正離子掃描為 1 300 V，負(fù)離子掃描為 1 500 V；樣品錐孔電壓60 V；提取錐孔電壓5.0 V；離子源溫度為110 ℃；碰撞能30 V；碰撞氣為氬氣；準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽溶液（556.277 1[M+H]⁺，554.261 5[M-H]-），掃描范圍m/z 100～1 500。

1.6 數(shù)據(jù)處理 目前，代謝組學(xué)海量數(shù)據(jù)處理是通過(guò)現(xiàn)代化學(xué)信息學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)領(lǐng)域的新方法對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘^[12]。將空白對(duì)照組和模型組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別以及峰匹配，并采用PCA對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，同時(shí)采用偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）方法對(duì)獲得的復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)差異性代謝物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，解析生物標(biāo)志物及相關(guān)的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 宏觀體征 在3次致敏過(guò)程中模型組大鼠與空白對(duì)照組的一般情況無(wú)明顯差異，尾靜脈激發(fā)給藥后，模型組大鼠均出現(xiàn)了明顯的精神萎糜、活動(dòng)減少、哮喘、痙攣等過(guò)敏反應(yīng)癥狀，但無(wú)動(dòng)物死亡；而空白對(duì)照組大鼠無(wú)明顯的過(guò)敏反應(yīng)癥狀。

2.2 生化指標(biāo)和病理切片 與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，模型組大鼠組胺和類(lèi)胰蛋白酶含量增加，且均具有顯著性差異（P<0.01），具體見(jiàn)表1，2。

細(xì)胞層完整，固有層可見(jiàn)膠原纖維和彈性纖維，可見(jiàn)血管、淋巴管以及淋巴組織。軟骨環(huán)完整。模型組氣管黏膜層和黏膜下層增厚，大部分假?gòu)?fù)層纖毛上皮細(xì)胞和固有層消失，細(xì)胞嗜堿性增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

空白對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完好；模型組肺動(dòng)脈血管見(jiàn)有擴(kuò)張淤血，大部分肺泡組織不張，肺泡隔增厚，有散在的炎細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠尿液UPLC-TOF-MS代謝輪廓和整體表征 2組大鼠第2次激發(fā)給藥后12 h尿液代謝產(chǎn)物利用ESI正離子模式分別采集對(duì)照組和模型組大鼠尿液樣本數(shù)據(jù)，得到尿液樣本的BPI圖。在優(yōu)化的分析條件下，正負(fù)離子掃描模式13 min的有效洗脫時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離和響應(yīng)效果，結(jié)果見(jiàn)圖3，4。

2.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)尾靜脈第2次激發(fā)后12 h大鼠尿液進(jìn)行檢測(cè)分析，用Markerlyns XS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息的獲取，進(jìn)行Pareto模式的PCA，采用OPLS-DA對(duì)2組尿液代謝物組進(jìn)行分析，得到反應(yīng)組間變化的Scores plot，見(jiàn)圖5，6。在正、負(fù)離子掃描模式下，2組聚類(lèi)分組明顯，代謝物表型差異顯著，表明模型組內(nèi)源性代謝物的含量發(fā)生了很大變化，說(shuō)明給予牛血清白蛋白后大鼠正常生理代謝紊亂，從代謝物組變化的角度可證明牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)模型造模成功。

2.5 表征過(guò)敏反應(yīng)標(biāo)志物的篩選及結(jié)構(gòu)鑒定 對(duì)空白組和模型組大鼠尿液進(jìn)行OPLS-DA分析，對(duì)VIP>2的差異變量進(jìn)行色譜峰提取并積分，進(jìn)行非參數(shù)t檢驗(yàn)，篩選P<0.05的數(shù)據(jù)變量得到有意義的生物標(biāo)志物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。采用MS/MS測(cè)定標(biāo)記物的精確信息，得到測(cè)定誤差范圍內(nèi)相應(yīng)的可能的化學(xué)物分子式；通過(guò)分子式及相對(duì)分子質(zhì)量在HMDB及KEGG等檢索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)合MS/MS選出可能的1種或幾種化合物，最終通過(guò)色譜保留行為以及MS/MS數(shù)據(jù)來(lái)確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在正離子檢測(cè)模式下，初步鑒定了8個(gè)生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)，在負(fù)離子檢測(cè)模式下，初步鑒定了6個(gè)生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)，具體見(jiàn)表3，4，分別為mahanimbinine，15-oxo-lipoxin A4，3-methyldioxyindole， isopentenyladenine-9-N-glucoside serinyl-valine， 7， 8-dihydroneopterin， 1-methylguanosine， norcotinine， 2′-hydroxydaidzein， 4， 6-dihydroxyquinoline，N-nitrosothialdine， alanyl-hydroxyproline， pterin， nicotinamide riboside。將鑒定出的標(biāo)志物輸入MPetA數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建分析代謝通路，見(jiàn)表3，4。

3 討論

經(jīng)前期試驗(yàn)摸索，從宏觀體征、生化指標(biāo)和肺、氣管的病理指標(biāo)判斷，過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型造模成功，本研究進(jìn)一步運(yùn)用代謝組學(xué)方法結(jié)合UPLC-MS分析技術(shù)，研究過(guò)敏反應(yīng)大鼠尿液中小分子內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律，并篩選出貢獻(xiàn)大的且有差異的特征性標(biāo)志物，初步判定14個(gè)生物標(biāo)記物^[13]，在對(duì)這些標(biāo)記物的研究發(fā)現(xiàn)15-oxo-lipoxin A4是脂氧素衍生物。脂氧素（LXS）和阿司匹林觸發(fā)脂氧素（ATL）是由花生四烯酸產(chǎn)生的促炎脂質(zhì)衍生的介質(zhì)，在結(jié)構(gòu)、形式和功能上區(qū)別于許多其他促炎脂質(zhì)衍生的介質(zhì)^[14]。脂氧素A4（LXA4）引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，并通過(guò)激活特異受體ALX調(diào)節(jié)白細(xì)胞在體內(nèi)的運(yùn)輸，通過(guò)花生四烯酸（AA2）衍生的類(lèi)二十烷酸，包括前列腺素（PG）和白三烯（LTs），對(duì)發(fā)揮局部免疫過(guò)敏和炎癥反應(yīng)具有重要作用。在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組5-氧代脂氧素A4有增加趨勢(shì)，表明大鼠體內(nèi)5-氧代脂氧素A4代謝發(fā)生紊亂，推測(cè)大鼠可能產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，也伴隨著炎癥的產(chǎn)生。

7，8-dihydroneopterin是通過(guò)用γ干擾素在刺激人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，曾在病毒感染和自身免疫性疾病人體體液中發(fā)現(xiàn)。該試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠尿液中7，8-dihydroneopterin有上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)大鼠可能產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)。

3-methyldioxyindole是乙醛脫氫酶的一個(gè)代謝物，在代謝中形成，是主要的尿代謝物。有學(xué)者認(rèn)為，3-甲基吲哚的體內(nèi)氧化產(chǎn)物是色氨酸的代謝產(chǎn)物，通過(guò)在結(jié)腸中的細(xì)菌產(chǎn)生的^[15]。

4，6-dihydroxyquinoline是在單胺氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化而來(lái)，是5-羥色氨酸的代謝通路轉(zhuǎn)化而來(lái)，5-羥色氨酸是5-羥色胺的前體物質(zhì)，查閱文獻(xiàn)^[13]發(fā)現(xiàn)5-羥色胺能促進(jìn)下丘腦釋放神經(jīng)遞質(zhì)的作用，故說(shuō)明下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的分泌被抑制。

pterin涉及到葉酸的生物合成通路，在此通路中pterin因主要合成葉酸而呈下調(diào)趨勢(shì)。葉酸的抗氧化應(yīng)激作用引起活性氧化基因（自由基、過(guò)氧化物等）的產(chǎn)生和抗氧化防御之間的失衡。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏性反應(yīng)和氧化應(yīng)激分子存在十分重要的關(guān)系。過(guò)敏性反應(yīng)時(shí)，肥大細(xì)胞激活后，刺激免疫系統(tǒng)（immune system），可以激活肥大細(xì)胞的活性氧（ROS），體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)，并通常作為氧化劑。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)特征性生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了14個(gè)潛在生物標(biāo)志物，并且呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)，這些生物標(biāo)志物主要與異黃酮、葉酸的生物合成，色氨酸、煙酸和煙酰胺的代謝等通路相關(guān)。通過(guò)對(duì)所述標(biāo)志物的代謝軌跡變化，探討過(guò)敏反應(yīng)的產(chǎn)生、發(fā)展過(guò)程，進(jìn)而從機(jī)體代謝通路異常來(lái)初步了解牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的代謝機(jī)制。下一步筆者將對(duì)其他生物標(biāo)志物與過(guò)敏反應(yīng)的具體聯(lián)系進(jìn)行深入研究，為避免藥物的過(guò)敏反應(yīng)提供理論支持。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]