盧明雪，黃潔萍，李 芬，馬 云

(信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000；信陽師范學院大別山農業(yè)生物資源保護與利用研究院，大別山家畜遺傳育種實驗室，河南 信陽 464000)

啟動子克隆技術及牛功能基因啟動子研究進展

盧明雪，黃潔萍，李 芬，馬 云*

(信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000；信陽師范學院大別山農業(yè)生物資源保護與利用研究院，大別山家畜遺傳育種實驗室，河南 信陽 464000)

基因啟動子(promoter)是DNA上決定RNA聚合酶轉錄起始位點的序列，是基因的一個重要組成部分，控制基因表達的起始和表達的程度，而基因表達的最終產物是RNA和蛋白質，這兩大類物質對維持生命活動不可缺少。因此，對基因的啟動子進行克隆并研究其功能對研究基因表達調控機制具有重要意義。本文主要就兩種常用的啟動子克隆技術和啟動子調控功能的研究進展做了簡要綜述，并對啟動子的研究前景做了展望。

啟動子克隆；牛；功能基因；調控功能

引言

基因的表達主要包括DNA的轉錄和RNA的翻譯兩部分，其中，DNA轉錄部分主要由該基因起始轉錄位點上游的啟動子序列所決定。啟動子元件包括核心啟動子元件和上游啟動子元件。核心啟動子元件決定了轉錄起始位點并起始轉錄，上游啟動子元件通過TFII-D復合物調節(jié)轉錄起始的頻率，提高轉錄效率。因此，啟動子控制基因表達的起始時間和表達的程度，是基因表達調控的重要順式作用元件，同時也是基因工程表達載體的一個重要元件，在整個基因研究領域發(fā)揮著重大的作用。因此，對啟動子的研究已成為近年來基因工程研究的熱點。在牛上，功能基因占很大比例，每個功能基因均存在啟動子，啟動子完整與否關系到該基因的表達與否及表達量的高低，進而影響對應的生理過程的發(fā)揮和相關表現型。因此，在對牛重要經濟性狀的研究中，對基因啟動子功能的研究是研究該基因對特定性狀的影響作用不可忽略的一部分。本文主要對兩種常用的啟動子克隆技術、功能基因啟動子調控功能研究進展方面做了簡要綜述，為功能基因啟動子的研究提供參考。

1 啟動子克隆技術的研究進展

1.1 利用啟動子探針載體篩選啟動子

利用啟動子探針載體篩選啟動子，是指通過將內切酶切割得到的不同擬啟動子片段連接到含有報告基因的載體上，檢測下游標志基因的表達活性以判斷擬啟動子片段的轉錄活性的一種方法。該方法選用適當的限制性核酸內切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產生的DNA限制片段群體與啟動子缺失質粒載體重組，并按照設計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉化給寄主細胞，構建質粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性，若檢測報告基因具有活性，則該插入重組DNA片段具有啟動子活性[1]。構建含報告基因的啟動子缺失質粒載體篩選啟動子是一種高效、快速分離啟動子的方法。

該方法的最早是由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報告基因構建了啟動子探針質粒pBRH3B，并克隆得到一些原核和真核啟動子片段。隨后，Fodor等[2]以大腸桿菌LacZ為報告基因構建了酵母啟動子探針質粒載體并克隆得到一些啟動子片段。同樣，Donna等[3]以氯霉素抗性基因作為報告基因，構建酵母啟動子探針質粒并克隆得到一些啟動子片段。張勇為等[4]以大腸桿菌質粒載體pBlue或pUC18為骨架，用大腸桿菌轉座子Tn903的卡那霉素抗性(Kan’)基因為遺傳標記，構建了啟動子探針型系列載體pSUPV。魏云林等[5]以pBR322質粒為基礎，用來源于質粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段作為遺傳標記，并在pBR322中插入Acinetobacter菌屬特異性ori的DNA片段，構建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常復制的啟動子探針質粒pBAP1，從而篩選強啟動子片段。張維等[6]以β-葡糖醛酸酶基因gusA作為報告基因，在乳酸菌表達載體pMG36e基礎上，構建了乳酸菌啟動子探針載體pMGPP，pMGPP的構建不僅為篩選乳酸菌啟動子提供了有效的工具，同時為高效乳酸菌表達載體的構建奠定基礎。杜寶華等[7]以半乳糖苷酶基因作為報告基因，構建啟動子活性探針載體pMPlacZ，并且其構建的啟動子活性檢測載體可以有效、靈敏地用于甲基營養(yǎng)菌MP688強啟動子的篩選和啟動子活性檢測。盡管該方法能夠用于隨即篩選啟動子，獲得大量未知序列啟動子片段，但不能特異分離某一特定基因的啟動子片段而使其應用受到局限。

1.2 利用PCR技術克隆啟動子

該方法主要對于已知的基因序列，即根據已經發(fā)表的基因序列設計引物，通過PCR技術克隆得到基因的啟動子，并構建含有報告基因的載體，轉染細胞后檢測報告基因的表達以判斷目的序列的轉錄活性。由于該方法比較簡便、快捷，近年來研究者們較多采用此方法克隆基因啟動子。

2012年，王秋華等[8]根據已公布的牛MyoG(Myogenin，肌肉生長相關因子)基因的啟動子序列，擴增啟動子缺失序列，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分別檢測啟動子序列野生型和突變型的轉錄活性，結果表明，日本和牛MyoG基因(ID:281343)的166～2125 bp區(qū)域內不同長度片段均存在不同轉錄活性，該結果為進一步研究MyoG基因的表達調控奠定了基礎。2013年，劉敏等[9]采用PCR技術擴增牛MSTN基因啟動子，亞克隆至熒光素酶表達載體pGL3-Basic中，構建重組報告載體pGL3-BasicMSTN-promoter，將重組報告載體pGL3-Basic-MSTN-promoter與內參質粒pRL-TK用脂質體法瞬時共轉染小鼠成肌細胞系C2C12和小鼠胚胎成纖維細胞3T3-L1，通過雙熒光素酶活性檢測其啟動子活性，結果成功構建了牛MSTN基因真核報告載體pGL3-Basic-MSTN-promoter，并且該載體在C2C12細胞和3T3-L1細胞中的啟動子活性比pGL3-Basic空載的活性高，這為進一步研究MSTN基因的表達調控機制奠定了基礎。為檢測牛在C2C12細胞系中的表達活性，2015年，段美艷等[10]通過PCR技術從牛基因組DNA中克隆獲得目ATP5B基因擬啟動區(qū)不同截短片段，成功構建7個系列缺失的牛ATP5B基因啟動子雙熒光素酶報告基因重組質粒，且證實-763～230 bp為牛ATP5B基因的核心啟動子區(qū)域。利用相同的方法，王明明等[11]研究發(fā)現牛MYOZ2基因啟動子核心區(qū)位于-84/+125 bp，而且MEF2，SRF，MyoD，YY1等轉錄因子可能參與MYOZ2基因的轉錄調控；陸杏蓉等[12]克隆獲得的水牛NOBOX啟動子能夠啟動EGFP在HEK-293T細胞上表達，也能夠啟動EGFP在CHO細胞上表達，且與CMV啟動EGFP在CHO細胞中的表達強度相似，表明獲得的水牛NOBOX是個強啟動子。2016年，Xu等[13]通過克隆小鼠IRF-3(The interferon regulatory factor 3，干擾素調節(jié)因子3)(mIRF-3)基因5'側翼區(qū)的核苷酸序列，并根據其在NIH3T3細胞中調控mIRF-3基因的轉錄活性的分子機制的特點，分析一系列5'缺失序列，結果顯示mIRF-3基因中的一段長301bp的片段(-255/+46)對于啟動子的活性是必不可少的，這個區(qū)域包含IK1， Egr2，Cmyb， E2F1 and YY1這5個假定的轉錄因子結合位點，之后通過siRNA策略敲除Egr2 或 YY1以及染色質免疫共沉淀試驗，最終結果表明NIH3T3細胞中的轉錄因子Egr2 和YY1能夠調控mIRF-3的基礎啟動子活性。

啟動子克隆技術的方法有很多，除利用啟動子探針載體篩選啟動子以及PCR技術克隆啟動子兩種技術外，還有利用環(huán)狀PCR(包括Inverse-PCR和Panhandle-PCR)、載體或接頭的染色體步行技術克隆基因啟動子、YADE法、TAIL-PCR等其他技術。這些已經被人們廣泛使用，每種方法都有各自的利弊，但因PCR技術更為方便、快捷，因此是目前人們使用最多的方法。

2 牛功能基因啟動子調控功能的研究進展

2.1 肉用性能相關功能基因啟動子調控功能的研究進展

1997年，Hinshelwood等[14]根據牛CYP19基因在子房(OV)和胎盤(PL)的特點， P450芳香酶(CYP19基因的產物)在牛和人的子房顆粒細胞中均能表達，然而在排卵之后只在人類黃體化的顆粒細胞能夠持續(xù)表達，之后在牛和人的CYP19基因的啟動子和5’側翼區(qū)亞克隆一個LUC(luciferase，熒光素酶)載體，轉染細胞檢測活性，結果表明在防止牛CYP19基因在黃體化的顆粒細胞中充分表達方面， CLS(cAMP-responsive element-like sequence ，類似cAMP應答元件的序列)發(fā)揮了重要的作用。2011年，王洪梅等[15]將牛Nramp1(Natural resistance-associater macrophage protein，天然抗性相關巨噬蛋白)基因起始轉錄位點上游不同長度片段連接到pEGFP-N1和/或pGL3重組質粒中，將獲得的重組質粒轉染293T和RAW264.7細胞，并進行脂多糖誘導，對不同片段的啟動子活性進行定性和定量測定，最終確定該基因啟動子核心區(qū)域和主要的調控區(qū)域。2013年，Wang等[16]將CMV增強子的一個片段與MyoG基因啟動子上游連接到一起，構建雙熒光素酶表達載體和4個真核基因表達載體，然后將這4個載體和內控的海腎熒光素酶報告基因載體phRL-TK轉染到牛的骨骼肌衛(wèi)星細胞中和牛犢成纖維細胞中，檢測雙熒光素酶報告體系中的啟動子活性，結果表明CMV增強子能夠顯著地提高MyoG基因啟動子在肌肉衛(wèi)星細胞中的轉錄活性，并且具有特異性，本研究在提高外源基因在牛肌肉細胞中的高效表達方面提供了試驗材料，并為獲得牛肌肉中啟動子的高特異性和轉基因肉牛提供了理論基礎。同年，李飛等[17]根據GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列，用PCR技術擴增牛MyoDⅠ基因的擬啟動子區(qū)域，構建載體并轉染293T細胞，分析發(fā)現擴增的關嶺牛MyoDⅠ基因擬啟動子區(qū)域具有轉錄活性。2014年，杜巍等[18]擴增牛結蛋白不同長度的啟動子截短片段，構建載體并轉染不同細胞，發(fā)現克隆的不同啟動子截短片段均存在不同程度的轉錄活性，這為轉基因肉牛的生產奠定了基礎。2015年，孫曉麗等[19]為獲得帶有高效特異性啟動子的IGF2(Insulinlike Growth Factor 2，胰島素生長因子)表達載體，研究其對牛骨骼衛(wèi)星細胞增殖的影響，成功構建了3種含有IGF2肌肉特異性啟動子desminpro、CMV-MyoGpro和MyoGpro-double的真核表達載體轉染牛骨骼肌衛(wèi)星細胞和胎兒成纖維細胞， RT-PCR檢測IGF2的相對表達量，從而篩選高效特異性的載體。結果表明，pGL3-desminpro-IGF2是較高效的并具有特異性的載體，載體轉染體外培養(yǎng)細胞提高了增殖速度，并上調了細胞周期相關基因CDK6和IGF2的表達，為轉基因肉牛的生產奠定了重要基礎。2016年，張雯等[20]通過設計特異性引物克隆關嶺牛MyoD基因家族CDS區(qū)和MyoD1啟動子片段P1和P2，同時利用雙酶切的方法分別將CDS區(qū)和克隆的啟動子序列連入pcDNA3.1(+)和p GL3-Basic基本骨架，構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-Myo G和含螢火蟲熒光素酶報告基因的報告載體，經酶切和測序鑒定后，將真核表達載體和報告載體轉染小鼠C2C12細胞，結果表明關嶺牛MyoD、Myf5和Myf6轉錄因子與關嶺牛MyoD1啟動子的作用位點不在其核心啟動子區(qū)P2上。

2.2 奶牛功能基因啟動子調控功能的研究進展

2013年，鄭宜文等[21]采用亞硫酸氫鹽測序(BSP)技術檢測了不同發(fā)育時期奶牛乳腺組織及不同乳品質泌乳期奶牛乳腺組織RPS6KB1啟動子的甲基化特征，實時熒光定量PCR檢測RPS6KB1基因mRNA差異表達，實驗結果顯示，在RPS6KB1基因啟動子內存在CpG及非CpG的甲基化模式，妊娠期奶牛甲基化程度高于泌乳期奶牛，熒光定量結果顯示不同發(fā)育時期RPS6KB1基因mRNA水平表達差異顯著(P<0.05)，說明RPS6KB1的表達受到其啟動子甲基化的調控，非CpG甲基化模式可能具有與CpG甲基化模式相似的生物學功能，參與RPS6KB1的表達調控。同年，韓立強等[22]從奶牛組織中克隆得到4個不同長度的SCD基因啟動子片段(分別為212、380、416和760bp)，采用生物信息學方法分析了啟動子上不同的轉錄因子結合位點，將克隆片段與pGL3-basic熒光素酶報告基因載體進行雙酶切，連接形成重組啟動子載體pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3、pGL3-SCD4，將載體純化后，瞬時轉染到HepG2細胞，之后檢測啟動子熒光素酶相對活性，結果表明pGL3-SCD4啟動子上增加的片段(-398～-742)可能對于SCD基因的表達調控具有重要的作用。2016年，Hou等[23]已知SYK(Spleen tyrosine kinase，脾酪氨酸激酶)在干乳期的乳腺組織中的表達量比在泌乳期中的高，奶牛的乳腺上皮細胞以及與細胞增殖有關的信號分子能夠影響SYK的表達水平，使用雙熒光素酶報告基因進行分析，表明SYK能夠增加AKT1基因啟動子的轉錄活性，這些結果表明，SYK激活AKT1在奶牛乳腺的轉錄水平影響乳腺上皮細胞的增殖，這在不產乳的奶牛的乳腺重塑過程中以及提高泌乳奶牛的泌乳持久力方面發(fā)揮重要的作用。

3 小結與展望

啟動子是基因的一個組成部分，控制基因表達的起始時間和表達的程度，啟動子就像“開關”，決定基因的活動。對啟動子進行研究不僅為研究物種進化規(guī)律以及生物的生長發(fā)育提供依據，也為研究疾病的治療提供理論依據。啟動子作為后基因組時代的研究重點，其調控表達中序列和功能的關系、拷貝數和功能的關系、在基因中的位置和功能的關系、不同啟動子之間復雜對應網絡和功能的準確對應關系等方面有廣闊的研究空間和發(fā)展前景，啟動子領域的研究進步是后基因組時代發(fā)展的重要體現，在牛領域中關于啟動子的研究更是取得了很大的進步，相信通過研究人員的不懈努力，能夠為啟動子的研究提供更多的理論依據和實驗依據。

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Progress of Promoter Cloning Technique and the Research of Functional Gene Promoters in Cattle

LU Ming-xue, HUANG Jie-ping, LI Fen, MA Yun*

(CollegeofLifeScience,XinyangNormalUniversity,Xinyang,Henan, 464000;InstituteforConservationandUtilizationofAgro-bioresourcesinDabieMountains,LaboratoryofDomesticAnimalGeneticandBreedinginDabieMountains,Xinyang,Henan, 464000)

Gene promoter is an important part of the gene, which is a DNA sequence determining RNA polymerase transcription start site. It can controls the start of gene expression and expression level. The gene expression products are mRNA and protein, which are necessary for maintaining the life activities. Thus, it is vital important to study on the promoter function of a gene and it’s regulation mechanism. In this paper, two common cloning technology and the regulation function of the promoter and prospected the in cattle were summarized .

promoter cloning; cattle; functional gene; regulatory function

2016-08-10

2016-08-15

本研究受國家自然科學基金(No.31172193)，河南省優(yōu)勢特色學科一期建設工程項目(大別山農業(yè)生物資源保護與利用特色學科群)、河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目 (No.14IRTSTHN012) 及信陽師范學院青年科學基金(2015037)資助。

盧明雪(1996-)，女，河南新鄉(xiāng)人，本科，主要從事生物科學研究。

*通訊作者：馬 云(1974-)，男，寧夏平羅人，博士，教授，主要從事生物技術與動物遺傳育種研究。

S823

A

1001-9111(2016)06-0048-04