唐旭霞葉再元

紫草素誘導甲狀腺髓樣癌TT細胞自噬的實驗研究

唐旭霞1葉再元2

目的探討紫草素能否誘導甲狀腺髓樣癌細胞發(fā)生自噬。方法采用透射電鏡觀察不同濃度紫草素對甲狀腺髓樣癌TT細胞發(fā)生自噬的形態(tài)。利用Western-blot分析紫草素作用甲狀腺髓樣癌TT細胞后自噬標志物Beclin-l和LC3蛋白的表達，利用熒光顯微鏡觀察自噬標記蛋白LC3-Ⅱ的點狀聚集情況。結(jié)果不同濃度紫草素作用24～72h對TT細胞均有自噬現(xiàn)象發(fā)生。2μg/mL、4μg/mL紫草素處理組作用24h后透射電鏡觀察TT細胞自噬的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)TT細胞出現(xiàn)典型的自噬囊泡：雙層膜包繞的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)。紫草素處理自噬相關(guān)基因Beclin-l的表達明顯低于空白對照組，參與自噬降解的p62表達水平下降，其下降水平與劑量呈相關(guān)性，自噬標記蛋白LC3-Ⅱ的表達明顯提高。將TT細胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒24h后,用紫草素處理24h,于熒光顯微鏡下觀察，處理組與空白對照組相比,胞漿上出現(xiàn)大量的LC3-Ⅱ點狀聚集。結(jié)論紫草素能誘導甲狀腺髓樣癌TT細胞發(fā)生自噬，透射電鏡下可見自噬體，熒光顯微鏡下可觀察到自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ。紫草素誘導TT細胞自噬,可能與降低自噬抑制基因Beclinl表達水平相關(guān)。

甲狀腺髓樣癌；TT細胞；紫草素；自噬；Beclin-l；LC3

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）來源于甲狀腺濾泡旁細胞（又稱C細胞），約占全部甲狀腺惡性腫瘤的5%～10%[1]。MTC屬中度惡性腫瘤，發(fā)病率女性略多于男性。近年來，天然藥物在腫瘤治療的過程中發(fā)揮著重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物單體化合物如紫杉醇、苦參堿等都具有較好的抗腫瘤作用[2]，尋找新的MTC新的治療靶點積極尋求對治療有效的藥物無疑具有重大意義。紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草干燥根，在我國有悠久的藥用歷史。紫草素具有抗腫瘤效果，對HL60人早幼粒細胞白血病細胞系[3]、肝癌[4-8]等均有作用，不僅能影響腫瘤細胞的代謝、增殖、分化、信號傳遞、基因表達等過程以阻礙腫瘤細胞的生長[9]，還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，有望成為有效的化學增敏劑。文獻報道，紫草素在誘導腫瘤細胞死亡多通過細胞凋亡，也有報道是通過非凋亡途徑誘導細胞死亡，即自噬和壞死樣程序性死亡[10-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紫草素對TT細胞有明顯的細胞毒作用，其表現(xiàn)為通過凋亡和自噬途徑誘導腫瘤細胞死亡。本實驗采用透射電鏡、熒光顯微鏡和Western-blot等技術(shù)，闡述紫草素誘導細胞自噬的作用及可能的機制。

1 實驗材料

1.1 材 料 人甲狀腺髓樣癌TT細胞株購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 藥物及試劑 紫草素購自Sigma公司，鼠抗人β-actin抗體、抗人多克隆抗體Beclin-l均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，抗人鼠單克隆抗體LC3購自美國Abcam公司。

2 實驗方法

2.1 甲狀腺髓樣癌TT細胞培養(yǎng)與傳代 人甲狀腺髓樣癌TT細胞為貼壁生長細胞。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，將TT細胞置于F-12K培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 透射電鏡樣品制備與觀察細胞自噬 取對數(shù)生長期細胞，以100×104個細胞濃度接種24h后進行加藥處理?？瞻讓φ战M細胞（僅加入RPMI 1640液）和處理組（以濃度為2、4μg/mL的紫草素處理TT細胞）24h細胞分別經(jīng)溫PBS液洗滌，胰酶消化細胞并離心，細胞沉淀用2%戊二醛4℃預固定，然后用0.1M，pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品，用1%鋨酸溶液固定，0.1M，pH7.0磷酸緩沖液漂洗樣品，梯度濃度（包括50%，70%，80%，90%，95%和100%）的乙醇溶液及純丙酮對樣品進行脫水處理。用包埋劑與丙酮的混合液處理滲透、包埋、超薄切片，切片用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色，采用日本JEOL公司JEM-1230型透射電鏡觀察。

2.3 Western-blot檢測自噬標志物Beclin1和LC3蛋白的表達 分別將2μg、4μg紫草素作用24h的TT細胞用預冷的PBS洗滌，6孔板各加入細胞組織裂解液（RIPA）100μL，加入3種蛋白酶抑制劑（pepstatin A、aprotinin、leupeptin）各0.5μL，收集細胞后冰浴、離心、取上清，測BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取80μg等量的蛋白質(zhì)液加入SDS聚丙烯酰胺凝膠各膠孔中電泳，獲取濾膜，并轉(zhuǎn)移到麗春紅工作液中染色，去離子水漂洗PVDF膜至麗春紅脫色。5%脫脂奶粉/PBS（封閉液）封閉2h。兔抗人actin、Beclin-I和LC3多克隆抗體用封閉液稀釋，4℃孵育過夜。5%脫脂奶粉TBST洗滌3次，加封閉液稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育2h。TBST洗滌3次，加ECL試劑，室溫孵育，在暗盒中覆蓋X線攝影膠片曝光。剪切曝光顯影的目的條帶膠片經(jīng)掃描、編輯后輸出。

2.4 熒光顯微鏡觀察GFP-LC3的點狀聚集 將處理好的玻片置于24孔板中，取處于對數(shù)生長期的HeP3B細胞，稀釋成2.0×105個/mL，并培養(yǎng)，每孔0.5mL，細胞貼壁后，轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，24h后，加入2μg/mL、4μg/mL紫草素處理細胞24h，用PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 實驗結(jié)果

3.1 透射電鏡樣品制備與觀察TT細胞自噬的形態(tài)

透射電鏡觀察，2μg/mL、4μg/mL紫草素處理組作用24h后細胞凋亡的形態(tài)呈典型自噬的細胞形態(tài)改變，即雙層膜包繞的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，同時可見自噬小體，見圖1（封三）。

3.2 Western-blot檢測自噬標志物Beclin-I和LC3蛋白表達 紫草素處理各組自噬標記性蛋白自噬相關(guān)基因Beclin-1表達明顯低于空白對照組，參與自噬降解的p62表達水平下降，其下降水平與劑量呈相關(guān)性，和LC3的表達明顯上升提示紫草素誘導自噬的發(fā)生，見圖2（封三）。

3.3 熒光顯微鏡觀察GFP-LC3的點狀聚集 將TT細胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒24h，用紫草素處理24h后于熒光顯微鏡下觀察，與對照組相比，4μg/mL紫草素組胞漿上出現(xiàn)大量的LC3點狀聚集，提示紫草素可以誘導TT細胞發(fā)生自噬，見圖3（封三）。

4 討論

腫瘤細胞的死亡方式主要有三種：壞死（necrosis）、凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）。其中自噬是現(xiàn)今研究比較熱門的一種程序性死亡方式，廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細胞環(huán)境穩(wěn)定,這一過程在細胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起重要作用[12]。自噬細胞在一定的脅迫因素如饑餓、外力損傷等刺激下可發(fā)生自噬，其典型形態(tài)學特征包括細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)多個具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡[11]，隨后與溶酶體結(jié)合并被降解。適度的自噬被認為是細胞耐受周圍不良生存環(huán)境的一種適應(yīng)方式，但過度的自噬行為將導致細胞死亡。

自噬的整個過程受基因調(diào)控，但到目前為止，其調(diào)控機制尚未研究清楚。研究表明，一般抑癌基因可誘導自噬，而癌基因則抑制自噬。mTOR和BeclinlhVPs34是自噬調(diào)控的中心[13-14]。自噬主要受兩個復合體的調(diào)節(jié)，即mTOR復合體和Beclin-I復合體。mTOR通路的激活則抑制自噬的發(fā)生，而Beclin-I復合體可促進自噬的發(fā)生。

Idikio[15]在對腫瘤標志物研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中LC3蛋白高表達，而Beclin-I表達下降。張艷紅等[16]應(yīng)用免疫組化染色法檢測78例乳頭狀甲狀腺癌和45例癌旁正常黏膜組織，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因PTEN和Beclin-l在乳頭狀甲狀腺癌組織中蛋白表達下調(diào)，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。另有研究[17-18]表明，雖然在正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌組織中LC3不表達,但是在阿霉素干預后LC3表達明顯增高，并提出使用自噬激活劑有可能對常規(guī)治療不敏感的甲狀腺癌患者有效。Gundara等[19]對19例甲狀腺髓樣癌患者的新鮮冰凍進行了分子生物標記物MicroRNAs的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MiRs-183,175有表達增加，MiR-9表達下降；對甲狀腺髓樣癌TT細胞進行MiRs-183基因敲除后發(fā)現(xiàn)LC3表達增高，由此推論可通過增加自噬途徑導致細胞死亡。同時也提示通過腫瘤細胞自噬有可能提高對腫瘤細胞的殺傷，為我們治療甲狀腺髓樣癌提供了新的治療思路。

電鏡仍是目前檢測自噬最經(jīng)典的方法。正常情況下LC3于胞質(zhì)中均勻分布。而自噬在細胞學上最主要的特征是細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的雙層或多層膜的細胞質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)[13，20]。本實驗以濃度為2、4μg/mL的紫草素處理TT細胞24h，如文中所述步驟固定、脫水、包埋，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后，以透射電鏡觀察示細胞的超微結(jié)構(gòu)可見部分典型的自噬形態(tài)：胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)獨立雙層膜，且大部分呈彎曲或C型，另有一些雙層膜已包繞部分胞質(zhì)或細胞器，甚至部分細胞核，形成封閉的雙側(cè)膜囊泡即自噬體，表明紫草素誘導的TT細胞死亡中,有細胞發(fā)生了自噬性活化。而空白對照組以0.1%的DMSO處理細胞，未見凋亡或自噬的典型形態(tài)。另外，LC3被認為參與自噬體的形成[21]，它與磷脂酞乙醇胺（PE）結(jié)合，定位在自噬體外膜上，其含量與自噬泡數(shù)量成正比。因此，LC3現(xiàn)已作為自噬體的特異性標記蛋白[22]。應(yīng)用與綠色熒光蛋白（GFP）結(jié)合的GFP-LC3來檢測自噬被認為是自噬檢測的金標準[23]。在本實驗中，經(jīng)綠色熒光FITC標記自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ，可以清楚顯示自噬在細胞中的分布，紫草素4μg/mL作用強于2μg/mL，紫草素作用后T細胞胞漿上出現(xiàn)大量的空白對照組沒有的點狀聚集，證明紫草素可以誘導TT細胞發(fā)生自噬。

綜上所述，紫草素能誘導甲狀腺髓樣癌TT細胞發(fā)生自噬，可能與降低自噬抑制基因Beclin-l表達水平相關(guān)，這將為甲狀腺髓樣癌的基因治療提供新思路。隨著對自噬研究的不斷深入，明確其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展以及預后的作用，通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的自噬活性，誘導腫瘤細胞的自噬死亡，在腫瘤的治療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

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（收稿：2015-11-10 修回：2015-12-30）

Shikonin-induced Autophagy of Human Medullary Thyroid Carcinoma TT Cells

TANG Xuxia1,YE Zaiyuan2.1 Department of Otorhinolaryngology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University,Hangzhou(310006), China;2 Department of Surgery,People's Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310014),China

ObjectiveTo investigate the influence of shikonin on autophagy of human medullary thyroid carcinoma TT cells in vitro.MethodsAfter shikonin treatment,the morphological features of TT cell autophagy was observed by electron microscope;the autophagic markers Beclin-I and LC3 proteins on TT cells was determined with Western Blotting;theLC3-II points was observed byfluorescence microscopy.Results4μg/mL shikonin for 24-72h induced autophagy of TT cells.The TT cells showed typical autophagy cyst with double round or oval shape structures.Compared with control group,the Beclinl gene expression was significantly lower in shikonin-treated group,and the expression of p62 decreased in a dose-dependent manner.The expression of autophagy marker protein LC3-II increased.When the TT cellswere transfected with GFP-LC3 plasmid for 24 hand treated with shikonin for 24h,a large amounts of LC3-II points was seen in shikonin-treated groups by fluorescence microscopy.ConclusionAftershikonin treatment,the autophagosome was seen by electron microscope and the autophagy marker protein LC3-II was found by fluorescence microscope,therefore shikonin was able to induce the autophagy of human medullary thyroid carcinoma TT cells,which may be related with downregulating autophagy suppressor gene Beclin-I.

Medullary carcinoma of thyroid;TT cells;Shikonin;Autophagy;Beclin-l;LC3

浙江省自然基金項目（No.LY13H130003）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（杭州310006）；2浙江省人民醫(yī)院外科（杭州 310014）

葉再元，Tel：13355713900；E-mail：zaiyuanye@163.com