章 黎高建莉張 樺李召東

傷科接骨片對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響

章 黎1高建莉2張 樺3李召東1

目的觀察傷科接骨片對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響。方法取BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為藥物+細(xì)胞組：傷科接骨片及飼料喂養(yǎng)+MC3T3-E1+明膠海綿；細(xì)胞組：?jiǎn)渭冿暳? MC3T3-E1+明膠海綿；陰性對(duì)照組：?jiǎn)渭冿暳?生理鹽水+明膠海綿。每組10只。在小鼠右側(cè)股部臀大肌下方制成肌袋，藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組用無菌明膠海綿吸附MC3T3-E1細(xì)胞懸液、陰性對(duì)照組用無菌明膠海綿吸附生理鹽水后植入肌袋內(nèi)。術(shù)后3天，藥物+細(xì)胞組將傷科接骨片（0.35g/片）用蒸餾水配制成濃度為20mg/mL的混懸液，按2.0mg/（g·d）劑量灌胃給藥，細(xì)胞組和對(duì)照組均灌胃給予2.0mg/（g·d）的蒸餾水。分別于建模后第4、8周每組各處死小鼠5只，取材后分別作大體、切片HE染色光鏡，以及掃描電鏡下觀察。結(jié)果 術(shù)后4周，藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組肌袋內(nèi)均可見新骨出現(xiàn)，術(shù)后8周兩組均形成松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)的板層骨，藥物+細(xì)胞組形成的板層骨結(jié)構(gòu)較細(xì)胞組更為成熟，成骨細(xì)胞數(shù)量更多，膠原纖維分泌量也更多，并有更多的鈣化結(jié)節(jié)形成。陰性對(duì)照組內(nèi)未見有明顯骨化現(xiàn)象。結(jié)論傷科接骨片可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的成骨作用。

小鼠；傷科接骨片；MC3T3-E1細(xì)胞；成骨能力

傷科接骨片是由海星、雞骨、三七、血竭、紅花等組成的純中藥制劑，主要功效活血化瘀，促進(jìn)骨折愈合等。已有研究[1]從組織學(xué)和生物力學(xué)等方面證實(shí)，該藥能明顯改善血液循環(huán)，促進(jìn)血腫機(jī)化，并促進(jìn)骨痂鈣化等作用。但到目前為止，該制劑對(duì)成骨細(xì)胞在體內(nèi)的作用仍不甚明了。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察傷科接骨片干預(yù)小鼠體內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨作用，探討其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡BALB/c小鼠30只（許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供），雌雄各半，體質(zhì)量為22～26g。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通級(jí)動(dòng)物房（動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)為SCXK（浙）2013-0184），定時(shí)投放食水，做好標(biāo)記，每周復(fù)稱體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室溫度為16-25℃，濕度為40%～80%。

1.2 主要材料 傷科接骨片（藥物組成：海星、雞骨、三七、血竭、紅花等，大連美羅中藥廠有限公司，0.35g/片，批號(hào)201410389）。MC3T3-E1細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供），取MC3T3-E1細(xì)胞株解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿約90%后用0.25%胰酶消化制成1×105/L的細(xì)胞懸液。地塞米松（Sigma公司）、高糖DMEM（Biogen Idec公司）、胎牛血清（Biogen Idec公司）、抗壞血酸（Sigma公司）、0.25%胰酶（Biogen Idec公司）、β-磷酸甘油鈉（Sigma公司）等。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（Thermo，SW-CJ-2FD，美國(guó)）、低速離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma，美國(guó)）、流式細(xì)胞儀（Moflo，Beckman Coulter）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、相差顯微鏡（Olympus）、照相機(jī)（Toshiba，日本）、熒光顯微鏡（Olympus）、數(shù)碼相機(jī)（Olympus）、石蠟切片機(jī)（Leca，德國(guó)）、XL-30環(huán)境掃描電子顯微鏡（Philips，荷蘭）、干燥儀（Abbott,LDM150D，美國(guó)）、HCP-2離子濺射儀（Hitachi，日本）等。

1.4 動(dòng)物分組和模型構(gòu)建 30只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只：（1）藥物+細(xì)胞組：傷科接骨片及飼料喂養(yǎng)+MC3T3-E1+明膠海綿；（2）細(xì)胞組：?jiǎn)渭冿暳衔桂B(yǎng)+MC3T3-E1+明膠海綿；（3）陰性對(duì)照組：?jiǎn)渭冿暳衔桂B(yǎng)+生理鹽水+明膠海綿。三組均經(jīng)腹腔內(nèi)注射0.25mL濃度為6g/L的戊巴比妥鈉麻醉，按文獻(xiàn)方法[2]于每只小鼠右側(cè)股部臀大肌下方作一1.0cm的皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，暴露肌肉組織，肌間隙內(nèi)以止血鉗鈍性分離制成肌袋，然后將0.5cm×2.0cm×2.0cm大小的無菌明膠海綿折疊后吸附2mL的1×105/L MC3T3-E1細(xì)胞懸液（藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組），或者2mL生理鹽水（陰性對(duì)照組）植入所制作的肌袋內(nèi)。逐層縫合切口，常規(guī)肌肉注射慶大霉素（4萬U/次，1天1次，3天）預(yù)防感染。術(shù)后將小鼠分籠飼養(yǎng)，每組均給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。3天后藥物+細(xì)胞組將傷科接骨片（0.35g/片）用蒸餾水配制成濃度為20mg/mL的混懸液，按2.0mg/（g·d）的劑量灌胃給藥，細(xì)胞組和對(duì)照組均灌胃2.0mg/（g·d）的蒸餾水。各組每日灌胃給藥1次，共8周。

1.5 取材及觀察 建模4、8周，各組隨機(jī)取小鼠各5只麻醉后斷頸處死，取肌袋內(nèi)實(shí)驗(yàn)材料后大體觀察。取部分組織雙醛固定（2%多聚甲醛+2.5%戊二醛）12h，10%EDTA脫鈣，常規(guī)組織學(xué)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。剩余部分組織立即放入2%戊二醛中固定2h以上，去除固定劑，用PBS漂洗2次，每次10min，再用1%餓酸固定1h，PBS清洗3遍，乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥脫水，表面噴金后掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 建模后4周各組所取材料可見明膠海綿均大部分被降解，藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組均見板層骨生成，但前者周圍肌肉內(nèi)部的硬化現(xiàn)象更為明顯。陰性對(duì)照組的肌袋內(nèi)除殘留部分明膠海綿外，未見明顯成骨現(xiàn)象。8周后，各組肌袋中明膠海綿均被降解完全。藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組所生成的板層骨組已更為成熟，并可見骨髓樣組織存在于板層間的髓腔內(nèi)，肌袋周圍可見骨化的肌肉并與肌袋內(nèi)骨相連。而陰性對(duì)照組未見明顯骨化現(xiàn)象。

2.2 光鏡觀察 光鏡下觀察，建模后4周可見藥物+細(xì)胞組較細(xì)胞組所形成新骨量多，但骨組織結(jié)構(gòu)尚不成熟，板層骨厚度較薄，內(nèi)部組織中見由多個(gè)軟骨細(xì)胞組成的軟骨島，其中部分軟骨細(xì)胞存在胞膜皺縮退化現(xiàn)象，軟骨島周圍有礦化帶，而在細(xì)胞組未見明顯軟骨島形成。8周光鏡下可見藥物+細(xì)胞組形成更為成熟的板層骨，孔隙相連，骨膠原和鈣沉積較多，屬類松質(zhì)骨樣骨。新形成的骨外有骨膜包繞，光鏡下可觀察到骨膜下成骨，見圖1（封二）。

2.3 電鏡觀察 高倍掃描電鏡下觀察8周取樣標(biāo)本，可見藥物+細(xì)胞組形成的板層骨為類似松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)，有較多的孔隙，孔隙的孔壁上有較多的成骨細(xì)胞，纖維樣膠原由成骨細(xì)胞所分泌，且在膠原之間聚集著較多的顆粒狀礦物質(zhì)。骨膠原與顆粒狀的礦物質(zhì)相互包繞形成結(jié)節(jié)樣突出；細(xì)胞組形成更疏松、更欠成熟的類松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)，并且只有少量纖維樣膠原和鈣結(jié)節(jié)形成，見圖2（封二）。

3 討論

MC3T3-E1細(xì)胞是一種通過分離培養(yǎng)從胎鼠顱骨中所獲取的前成骨細(xì)胞，具備向成骨細(xì)胞單向分化的特性，具有相應(yīng)的成骨化能力，而且其細(xì)胞形態(tài)、表型和功能均與成骨細(xì)胞相似。成骨細(xì)胞雖為成熟細(xì)胞但不具備分裂增殖能力，而前成骨細(xì)胞具有強(qiáng)大的分裂增殖的能力，因此，MC3T3-E1細(xì)胞是研究成骨細(xì)胞的常用替代細(xì)胞系[3]，該細(xì)胞體外培養(yǎng)下能夠分泌ALP，I型和Ⅲ型膠原，形成鈣結(jié)節(jié)[4]，植入動(dòng)物肌袋內(nèi)后具有形成板層骨的能力，因此本實(shí)驗(yàn)選擇MC3T3-E1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，觀察傷科接骨片的促成骨能力。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大體、光鏡和掃描電鏡觀察，藥物+細(xì)胞組和細(xì)胞組兩組雖然MC3T3-E1的成骨結(jié)構(gòu)相似，但成骨能力前者要高于后者。前者實(shí)驗(yàn)組中所形成的類似于松質(zhì)骨樣的板層骨更為成熟，骨結(jié)構(gòu)中有較多的成骨細(xì)胞以及多個(gè)孔隙相通，成骨細(xì)胞分泌較多的膠原和礦物質(zhì)顆粒，兩者相互纏繞形成結(jié)節(jié)突向孔隙內(nèi)。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，成骨模式有成骨細(xì)胞直接成骨、軟骨內(nèi)成骨和骨膜下成骨。成骨細(xì)胞的再生是骨折愈合的基礎(chǔ)，在充分的血液供應(yīng)下，骨折局部間葉細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的數(shù)量增加，因此，成骨細(xì)胞所形成骨基質(zhì)和基質(zhì)鈣化亦得到保證。姜琳等[5]觀察到，小鼠骨折2周，傷科接骨片組小鼠骨痂中見到成熟活躍的成骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似現(xiàn)象，藥物+細(xì)胞組中成骨細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于對(duì)照組。由此可見，傷科接骨片可以促進(jìn)動(dòng)物骨痂中的成骨細(xì)胞增殖分化。

骨中的膠原纖維主要為I型膠原，占全部膠原的90%，是成骨細(xì)胞合成的特異性膠原，在骨組織中具有加大機(jī)械力量的作用。傷科接骨片中的動(dòng)物類藥（海星、雞骨、土鱉蟲）可以為骨膠原合成提供所必需的多種氨基酸，發(fā)揮其促進(jìn)膠原合成的作用。魏玉玲等[6]觀察到傷科接骨片藥物組與對(duì)照組比較，I型膠原mRNA的表達(dá)量無論在骨折后2周或4周，前者均大于后者，說明傷科接骨片能促進(jìn)骨折的骨化和塑型，增進(jìn)骨折愈合的質(zhì)和量。本實(shí)驗(yàn)中，也同樣發(fā)現(xiàn)藥物+細(xì)胞組中纖維性膠原生成量高于細(xì)胞組，顯示傷科接骨片可通過激活成骨細(xì)胞的活性促進(jìn)膠原合成，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的。此外，傷科接骨片富含的鈣質(zhì)可成為軟骨成骨和骨痂的改造塑形的鈣質(zhì)來源，也為本實(shí)驗(yàn)中藥物+細(xì)胞組新生骨內(nèi)含量較多的鈣顆粒提供了來源依據(jù)。已有研究[7]證實(shí)，接骨片能縮短類骨質(zhì)的礦化延遲時(shí)間，促進(jìn)類骨質(zhì)提前鈣化，使骨痂提早成熟。

綜上所述，傷科接骨片可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的成骨作用，有利于成骨細(xì)胞的增殖分化，膠原合成及基質(zhì)鈣化等，故對(duì)骨折愈合有明顯的促進(jìn)作用。

［1］宮麗，張繼平.傷科接骨片促進(jìn)骨折愈合研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（5）：92-94.

［2］張一，孫立，簡(jiǎn)月奎，等.雙基因活化納米骨漿的體內(nèi)成骨［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18（3）：329-334.

［3］Calvert JW，Chua WC，Gharibjanian NA，et al.Osteoblastic phenotype expression of MC3T3-E1 cells cultured on polymer surfaces［J］.Plast Reconstr Surg，2005，116（2）：567-576.

［4］Chen VJ，Smith LA，Ma PX.Bone regeneration on computerdesigned nano-fibrous scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27 （21）：3973-3979.

［5］姜琳，魏玉玲，楊洪平，等.傷科接骨片促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨折愈合的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.中醫(yī)正骨，2000，12（11）：3-4.

［6］魏玉玲，王炳南，粱克玉.傷科接骨片對(duì)I、II型膠原基因表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)正骨，1998，10（5）：3-5.

［7］黃長(zhǎng)聯(lián)，董海輝，周建光，等.跌打接骨片促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨折愈合的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)研究［J］.中醫(yī)藥研究，2001，17 （4）：47-49.

（收稿：2015-12-14 修回：2016-01-12）

Effects of Shangke Jiegu Tablet onthe Role of MC3T3-E1 Cells in Osteogenesis PromotionIn Vivo

ZHANG Li1,GAO Jianli2,ZHANG Hua3,LI Zhaodong1. 1 Department of Clinical Laboratory,Traditional Chinese Medical and Western Medical Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310003),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Deparptment of Orthopaedic Surgery,Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310009),China

ObjectiveTo investigate the effects of Shangke Jiegu Tablet on the the role of MC3T3-E1 cells in osteogenesis promotionin vivo.MethodsThirty healthy BALB/c mice were randomly divided into 3 groups（10 rats each）:drug+cell group,cell group,and negative control group.During the animal operation,the muscle pouch was made in the right thigh of the mouse,and the sterile gelatin sponge was used to absorb the MC3T3-E1 cell suspension or saline.Conventionaldiet was given after operation,and 3days later,the above groups were given treatment by gastrogavagerespectively as follows:Shangke Jiegutablets（0.35g/tablet）withdistilled water toa concentration of 20mg/mL suspension,and 2.0mg/（g·d）in drug+cell group;2.0mg/（g·d）of distilled water incellgroup and negative controlgroup.Every 5 mice were executed at 4 and 8 weeks after oral adiministration,and the specimens were harvested and observedwith HE staining and light microscope and scanning electron microscopy.ResultsFour weeks after operation,the new bone appeared in the drug+cell and cell groups;at 8 weeks,the cancellous bone with a lamellar structure was formed in both groups.In drug+cell group,more mature cancellous bone,collagen secreted by osteoblasts,and calcified nodules were formed compared withcell group.No new bone was observed in negative control group.ConclusionShangke Jiegu tablet is conducive to the osteogenesis induced by MC3T3-E1 cells in vivo.

Mice;Shangke Jiegu tablet;MC3T3-E1 cells;Osteogenesis

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（No.20110101120122）

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州310003）；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科（杭州 310009）

李召東，E-mail：dglihh@126.com