苦參黃酮類化合物與SGLT2同源蛋白2XQ2的分子對接研究

崔海東1，馬玉卓1，戴雪娥2，劉鷹翔2

(1.廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 利用分子對接技術(shù)，探討苦參黃酮類提取物與鈉-葡糖共轉(zhuǎn)運蛋白2(SGLT2)之間的作用關(guān)系。方法 采用Molegro Virtual Docker(MVD)分子對接軟件，以SGLT2同源蛋白2XQ2為受體模板，對從苦參中提取的5個黃酮類化合物進行分子對接研究。結(jié)果 5個化合物與2XQ2發(fā)生分子對接的MVD分值分別為-115.8、-129.0、-147.6、-104.1、-100.9 kJ·mol`(-1)。結(jié)論 5個苦參黃酮類提取物均可與2XQ2進行分子對接，對接的結(jié)合位點信息有助于該類化合物抑制SGLT2活性機制的闡釋。

關(guān)鍵詞:鈉-葡糖共轉(zhuǎn)運蛋白2； 苦參黃酮類提取物； 分子對接； 結(jié)合位點

中圖分類號:Q74

文獻標志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.007

文章編號:1006-8783(2015)01-0031-05

Abstract:Objective To study on the relationships about the flavonoids extracts from sophora with SGLT2 by using the molecular docking technology. Methods Molegro Virtual Docker program was used to study the mechanism of interaction between 2XQ2 and five flavonoids from sophora.Results The five compounds could bind to 2XQ2 by high affinity scores with -115.8,-129.0,-147.6,-104.1,-100.9 kJ·mol`(-1),respectively. Conclusion The molecular docking result provided the mechanism of the reason why this type of compounds inhibited the target protein SGLT2.

收稿日期：2014-10-22

基金項目：廣東省科學計劃項目(2011B031800232)

作者簡介：崔海東(1989—)，男，2012級碩士研究生，Email:cuihaidongwww@126.com；通信作者：馬玉卓，女，副教授，主要從事藥物化學和藥物設(shè)計的研究，Email:mayuzhuo66@163.com。

Study on the molecular docking of SGLT2 homologous protein 2XQ2 and flavonoids from sophora

CUI Haidong1,MA Yuzhuo1,DAI Xue′e2,LIU Yingxiang2

(1.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofChineseMeteriaMedica,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Key words:SGLT2; the flavonoids from sophora; molecular docking; binding site

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-01-13 15:38網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150113.1538.009.html

糖尿病(diabetes mellitus)是一種糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙性疾病，主要表現(xiàn)為高血糖和尿糖[1]。腎臟的葡萄糖再吸收增加是引起糖尿病患者高血糖的重要原因之一。鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白(sodium-glucose co-transporter，SGLT)是一類存在于小腸黏膜(SGLT1)和腎臟近端小管(SGLT1和SGLT2)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族。SGLT2是一種親和力低的轉(zhuǎn)運蛋白，在腎臟特異性表達和近曲小管的葡萄糖再吸收中起重要作用[2]。

SGLT2抑制劑可阻遏腎近曲小管SGLT2轉(zhuǎn)運蛋白，防止已濾過的葡萄糖在腎臟內(nèi)再吸收，繼而清除尿液中過量的葡萄糖，由此達到控制糖尿病患者體內(nèi)高血糖的目的。目前，SGLT2已成為新型抗糖尿病藥物設(shè)計的靶標蛋白。

苦參是一種傳統(tǒng)中藥，具有廣泛的生物活性和藥理作用[3]。據(jù)楊新洲等[4]報道，苦參黃酮類化合物對SGLT2顯示不同程度的抑制活性；但是，這些化合物如何與SGLT2發(fā)生相互作用并抑制其活性的作用機制尚不清晰。本文采用分子對接技術(shù)，選取三葉豆紫檀苷(1)、(-)-高麗槐素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(2)、乙酰三葉豆紫檀苷(3)、羅思菌素(4)、芒柄花苷(5)等5個活性較好的苦參黃酮類化合物(結(jié)構(gòu)見圖1)與SGLT2同源蛋白進行對接，參比分子選取上市藥物SGLT2抑制劑達格列凈(dapagliflozin，6)，希望為苦參黃酮類化合物抑制鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白的作用機制提供初步的試驗依據(jù)。

1.三葉豆紫檀苷; 2.(-)-高麗槐素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷; 3.乙酰三葉豆紫檀苷; 4.羅思菌素; 5.芒柄花苷; 6.達格列凈。

圖1苦參黃酮類提取物及達格列凈的結(jié)構(gòu)

Figure 1Structure of the flavonoids and dapagliflozin

1方法

1.1　受體的準備

弧菌半乳糖共轉(zhuǎn)運蛋白(vSGLT)是SGLT2的同源蛋白[5]，二者的保守性結(jié)合口袋在序列和結(jié)構(gòu)上具有一致性，因此，vSGLT的受體模板(PDB code：2XQ2)可選作用于SGLT2蛋白-配體相互作用的研究[6-7]。

由PDB蛋白質(zhì)庫(http://www.rcsb.org)中下載所需的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)2XQ2，在進行分子的對接之前，利用SYBYL軟件對分子進行除去蛋白質(zhì)中的配體分子，并進行加氫、加電荷、氨基酸殘基修復等預處理，保存為mol2/pdb格式，備用。

1.2　配體的構(gòu)建

使用SYBYL軟件對包括參比分子達格列凈[7](6)在內(nèi)的6個小分子進行三維結(jié)構(gòu)的繪制，并對三維結(jié)構(gòu)進行能量優(yōu)化、加氫、加電荷等預處理，然后以mol2格式導出，備用。

1.3　 Molegro Virtual Docker(MVD)軟件

MVD是一款由CLC Bio生物信息學軟件公司開發(fā)的基于MolDock的演算預測小分子和大分子相互作用的分子對接軟件，能夠根據(jù)配體準確地預測大分子蛋白的活性位點，是一款精確的半柔性分子對接程序，通過增加限定因素，可提高受體-配體相互識別的準確度，與其他對接軟件相比，具有準確度高的優(yōu)勢(MVD:87%，Glide:82%，AutoDock:42%，F(xiàn)lexx:58%)。

1.4　對接程序

采用標準MVD對接程序進行分子的對接，對接時應(yīng)保證對接范圍為球形，半徑設(shè)置為1.5 nm，其他參數(shù)默認。將得到的配體構(gòu)象進行成簇分析，參數(shù)設(shè)置為0.05 nm，氫鍵供體-受體之間的最大距離設(shè)置為0.03 nm，然后基于對接的分子能量對結(jié)合模式進行打分，運行100次，最后根據(jù)成簇情況和最低Mol Dock Score合理選取對接結(jié)果。重復操作，最后得到所有分子的最優(yōu)結(jié)合模式和最低結(jié)合能量值[8-9]。

2結(jié)果

2.1　參比對照達格列凈與2XQ2的分子對接

達格列凈是C-苷類SGLT2抑制劑，結(jié)構(gòu)上含有1個氯代的苯環(huán)中心和1個乙氧基取代的苯環(huán)，可以選擇性地作用于SGLT2蛋白。本文選擇達格列凈作為苦參黃酮提取物與2XQ2對接的參比分子。

達格列凈與靶標蛋白2XQ2的對接結(jié)果(表1)顯示：達格列凈與2XQ2對接的結(jié)合位點處于二聚體蛋白A鏈和B鏈共同作用所形成的結(jié)合腔內(nèi)，其中氯代苯環(huán)以及乙氧基取代的苯環(huán)處在由Ile253A、Trp257A、Ile97A、Phe496B、Phe489B、Trp257A等殘基共同形成的疏水口袋中，糖基部分則延伸至極性相對較大的區(qū)域，并與周圍Gly255A、Leu484A、Gly254A、Leu488B、Val258A等殘基發(fā)生相互作用；另外，達格列凈糖基上的6位和2位羥基分別與Gly254A和Leu488B形成氫鍵作用，這與Akira等[6]報道的SGLT2與抑制劑相互作用的結(jié)合方式一致(見圖2A～圖C)。

A. Akira等[6]報道的SGLT2抑制劑與vSGLT的結(jié)合位點圖(彩色為小分子抑制劑；灰色為蛋白骨架A鏈和B鏈飄帶圖);

B. 參比分子達格列凈與2XQ2對接結(jié)合位點的飄帶圖(綠色為陽性分子達格列凈；藍色為2XQ2的A鏈飄帶；紅色為2XQ2的B鏈飄帶；球棍模型為與抑制劑有相互作用的小分子); C.達格列凈與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖(綠色為達格列凈;藍色為氫鍵;球棍模型為與達格列凈相互作用的氨基酸殘基)。

圖2達格列凈與2XQ2的分子對接結(jié)果

Figure 2The results of dapagliflozin binding with 2XQ2

2.2　苦參黃酮類提取物與2XQ2的分子對接

如圖3A、B所示，盡管相互作用的氨基酸殘基有所變化，黃酮類化合物1與2XQ2的結(jié)合模式仍與達格列凈保持一致，化合物1的苷元部分處在由Thr540A、Ala536A、Tyr539A、Phe469B、Ile249A等殘基形成的疏水結(jié)合腔中，羰基則對應(yīng)的延伸至相對極性區(qū)域并與Leu488B、Phe489B、Val482B、Ile253A、Trp257A等氨基酸殘基形成非共價鍵作用，其中糖基上的1位氧與6位羥基分別與Trp257A、Leu488B、Tyr485B形成氫鍵。

A.化合物1與2XQ2對接結(jié)合位點的飄帶圖; B.化合物1與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖; C.化合物2、3與2XQ2對接結(jié)合位點的飄帶圖(綠色為化合物2，黃色為化合物3); D.化合物2、3與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖; E.化合物4、5與2XQ2對接結(jié)合位點的飄帶圖(綠色為化合物4，黃色為化合物5); F.化合物4、5與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖。

圖3苦參黃酮類提取物與2XQ2的分子對接結(jié)果

如圖3C、D所示，化合物2、3與2XQ2的結(jié)合方式與化合物1類似，苷元填充在結(jié)合位點的疏水中心，糖基處于極性區(qū)域。與化合物1相比，少量與底物能形成相互作用的氨基酸殘基發(fā)生了變化，化合物2、3中糖基部分的2位羥基可與Tyr485B形成氫鍵結(jié)合，糖基的6位可與A鏈的Gly254A上的殘基形成氫鍵結(jié)合。值得說明的是，化合物2的4位羥基同時與A鏈的Gly254A上的殘基形成氫鍵結(jié)合，與6位羥基形成了橋接，推測與化合物2的4、6位羥基取象一致有關(guān)。

如圖3E、F所示，化合物4、5的結(jié)合方式相同，并與達格列凈(6)的結(jié)合位點保持一致，其中，6位羥基與氨基酸殘基Leu252A形成氫鍵結(jié)合。

分子對接的親和力、能量值和與其相互作用氨基酸殘基如表1所示，黃酮類化合物與2XQ2的對接MVD分值分別為-115.8、 -129.0、-147.6、 -104.1、

-100.9 kJ·mol-1，其中化合物2、3的對接分值高于參比對照達格列凈(6)。

3討論

分子對接思想源自1894年德國化學家Fisher提出的“鎖-鑰”學說，其原理是從已知結(jié)構(gòu)的受體和配體出發(fā)，通過化學計量的方法模擬識別藥物分子與生物大分子之間的相互作用，并最終獲得可能產(chǎn)生的各種類型的藥理作用，該方法現(xiàn)已廣泛用于藥物的虛擬篩選、定量構(gòu)效關(guān)系研究。但是，采用分子模擬進行中藥活性成分與藥物靶標對接從而探討藥理作用機制的研究才剛剛起步。

本文選擇具有抑制SGLT2活性的5個苦參黃酮提取物作為研究對象，開展與SGLT2同源蛋白2XQ2的分子對接研究，分別將陽性對照達格列凈和5個苦參黃酮提取物與2XQ2進行分子對接，結(jié)果顯示，所有對接小分子的最優(yōu)構(gòu)象均處在二聚體蛋白A鏈和B鏈共同作用形成的結(jié)合位點區(qū)域，其中苷元均處在A、B鏈共同作用形成的疏水腔內(nèi)，而糖基則延伸至A、B鏈的相對極性區(qū)域，這與文獻[6]所報道的SGLT2小分子抑制劑作用于SGLT2蛋白A、B鏈之間的結(jié)果相一致。

Figure 3　The binding results of flavonoids with 2XQ2

另外，黃酮類化合物作為配體與2XQ2對接的結(jié)果顯示，化合物3較其他小分子的對接分值高。進一步的對接構(gòu)象分析顯示：化合物3糖基的6位乙?；蛇M一步延伸并與相應(yīng)的氨基酸殘基結(jié)合，而其他小分子均無乙?；崾咎腔?位羥基的衍生化可能利于抑制劑與靶點蛋白的結(jié)合。

SGLT2與糖尿病有著密切的關(guān)系。目前的研究顯示，苦參中提取的5個黃酮類化合物均能夠和SGLT2同源蛋白2XQ2對接成功，其對接位點的信息為分析該類化合物抑制SGLT2活性的機制提供了一定的試驗依據(jù)。

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(責任編輯:陳翔)