黃芪散對糖脂代謝和骨生物力學(xué)指標(biāo)影響的實驗研究

羅嬌艷1，2，王芳1，2，張娟1，李衛(wèi)民1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 研究黃芪散對高脂飼料合并STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠糖脂代謝和骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響。方法 180～200 g雄性SD大鼠，一次性低劑量(35 mg/kg)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)+高脂飼料(HFD)誘導(dǎo)12周，造成2型糖尿病(T2DM)模型。造模的同時灌胃黃芪散(HQS),觀察血糖、血脂、胰島素、胰島素敏感性、體質(zhì)量、肝系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)和骨生物力學(xué)等指標(biāo)。 結(jié)果 黃芪散能顯著降低模型大鼠空腹血糖(FPG)、空腹血漿胰島素(fasting plasma insulin， FINS)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，減輕體質(zhì)量、降低肝系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)，提高胰島素敏感性，提高股骨最大載荷、最大吸收能量和結(jié)構(gòu)硬度。結(jié)論 黃芪散能顯著改善T2DM模型大鼠的糖脂代謝，降低體質(zhì)量、肝系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)，提高胰島素敏感性，并能改善骨生物力學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:黃芪散； 糖脂代謝； 胰島素敏感性； 骨生物力學(xué)

中圖分類號:R285

文獻標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.017

文章編號:1006-8783(2015)01-0075-05

Abstract:Objective To investigate the effect of Huangqi San (HQS) on the glucolipid metabolism and skeletal biomechanical properties in STZ-induced type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats. Methods The T2DM model was replicated in 180-200 g male rats with disposable low-dose intraperitoneal injection of 35 mg/kg STZ and administration of high fat diet for 12 weeks. Meantime,HQS was administrated by intragastric gavage. The glucose and lipid parameters of total cholesterol (TC),triglyceride (TG),low density lipoprotein cholesterol (LDL-C),fasting plasma insulin (FINS),insulin sensitivity,the body weight,the liver coefficient,the perirenal fat coefficient and skeletal biomechanical properties were investigated. Results HQS reduced FPG,FINS,TC,TG,LDL-C,the body weight,the liver coefficient,the perirenal fat coefficient,and improved insulin sensitivity,the maximum load and the energy absorption of femur. Conclusion HQS can improve the glucolipid metabolism,reduce the body weight,the liver coefficient,the perirenal fat coefficient,and improve insulin sensitivity and skeletal biomechanical properties in T2DM rats.

收稿日期：2014-10-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81373775)

作者簡介：羅嬌艷(1981—)，女，助理研究員，主要從事中藥新藥研發(fā)，Email：luojy11@163.com；通信作者：李衛(wèi)民，男，教授，

Effect of Huangqi San on the glucolipid metabolism and skeletal biomechanical properties in T2DM rats

LUO Jiaoyan1,2,WANG Fang1,2,ZHANG Juan1,LI Weimin1

(1.SchoolofChinesePharmaceuticalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Key words:Huangqi San; glucolipid metabolism; insulin sensitivity; skeletal biomechanical property

博士，主要從事中藥新藥研發(fā)，Email：liweimin@gzucm.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-01-08 15:57網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150108.1557.002.html

糖尿病，尤其是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)被世界衛(wèi)生組織列為繼腫瘤和心血管疾病之后的第3大人類疾病，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，全世界有近3.5億人受此影響[1]。糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病引起的其中一種并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計，糖尿病引起的骨質(zhì)疏松發(fā)病率為20%～60%[2-3]，骨折發(fā)病率為2%～12%[4]，對患者后期生活質(zhì)量造成極大影響。因此，開展糖尿病及其并發(fā)癥的防治已成為目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點。糖尿病與中醫(yī)的“消渴”相似，屬于中醫(yī)“消渴”的范疇，因此，部分糖尿病人在中醫(yī)臨床常按消渴辨治。

黃芪散方來源于北宋《圣濟總錄》，全方由葛根、黃芪、桑白皮3味藥按質(zhì)量比2∶1∶1的比例組成，原文記載其“治三消渴疾”。前期實驗已證明黃芪散分別能提高正常小鼠、T2DM小鼠和內(nèi)、外源性脂代謝異常大鼠模型的胰島素敏感性[5-6]。本研究采用低劑量STZ+高脂飼料誘導(dǎo)的T2DM大鼠，對黃芪散改善糖脂代謝、提高胰島素敏感性的藥理作用進行驗證，并觀察黃芪散對T2DM大鼠模型骨生物力學(xué)的影響。

1材料

1.1　藥物與試劑

黃芪散提取物，本實驗室自制。將黃芪散藥材(葛根∶黃芪∶桑白皮=2∶1∶1)用60%(φ)乙醇提取，提取液濃縮至質(zhì)量濃度為0.12 g/mL，通過PIPO-OO樹脂、HPD-500樹脂大孔樹脂及732離子交換樹脂的三節(jié)高壓串聯(lián)樹脂。先用水洗脫三節(jié)串聯(lián)樹脂，再分別用40%、70%(φ)的乙醇洗脫兩節(jié)串聯(lián)的大孔樹脂，氨水洗脫732樹脂，收集洗脫液。濃縮，干燥得浸膏。浸膏得率為21.17%。以桑根酮D、桑根酮C、葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量作為內(nèi)在質(zhì)量控制指標(biāo)。

STZ(Sigma)；肝素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；檸檬酸、枸櫞酸鈉均為分析純(天津市大茂化學(xué)儀器廠)；葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)；胰島素測定試劑盒(艾萊薩生物科技有限公司)。

1.2　實驗儀器

RT-2100C自動酶標(biāo)儀(深圳雷杜)；BINDER烘箱、T10勻漿機(德國IKA)；CT14RD高速冷凍離心機(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；SNDMBA13AER強生穩(wěn)豪倍易型血糖儀(強生醫(yī)療器材有限公司)；穩(wěn)豪型血糖試紙(強生醫(yī)療器材有限公司，批號：0200180104)；LR5 plus Lloyd生物力學(xué)試驗機(英國Lloyd儀器公司)。

1.3　實驗動物與飼料

SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0020；高脂飼料和基礎(chǔ)飼料均由廣東省實驗動物中心提供，飼料合格證號：SCXK(粵)2013-0002；高脂飼料配方:蔗糖20%、膽固醇1.2%、豬油20%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、基礎(chǔ)飼料47.8%。

2方法

2.1　T2DM模型大鼠的制備

參照文獻[7]方法，略做調(diào)整。SD大鼠約50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水16 h，乙醚淺麻，毛細(xì)管眼底靜脈叢取血，檢測基礎(chǔ)空腹血糖(FPG)、TC、TG水平。3 d后，禁食不禁水16 h，按照35 mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(留取10只作為正常組大鼠，腹腔注射等體積蒸餾水)。2周后，待大鼠血糖穩(wěn)定后，禁食不禁水16 h，檢測大鼠FPG、TC、TG水平，剔除FPG<7.8 mmol/L的大鼠，根據(jù)入選大鼠的FPG、TC、TG、體質(zhì)量等指標(biāo)進行分組。除正常大鼠喂飼基礎(chǔ)飼料外，其余大鼠均喂飼高脂飼料12周，直至實驗結(jié)束，造成T2DM大鼠模型。

第7周末，大鼠禁食不禁水16 h后，眼底靜脈叢取血；第10周末，行OGTT實驗；第12周，大鼠禁食不禁水16 h后，眼底靜脈叢取血；第12周末，禁食不禁水16 h，稱體質(zhì)量后處死大鼠，剖取心、肺、肝、腎及腎周脂肪等臟器，稱取臟器質(zhì)量。

2.2　分組與給藥

將模型大鼠分為模型組(MC)和黃芪散組(HQS)，每組10只。各組動物灌胃給藥，每日1次。其中正常(NC)組與MC組灌服10%阿拉伯樹膠(溶媒)，HQS組灌服黃芪散溶液，參照前期研究基礎(chǔ)[8]，給藥劑量2.96 g/kg，劑量設(shè)置為臨床等效劑量的2倍。

2.3　指標(biāo)檢測

(1)血液生化：FBG、空腹血漿胰島素(FINS)、TC、TG、LDL-C的測定均按試劑盒說明書進行。(2)OGTT實驗：大鼠禁食不禁水16 h后，灌胃2 mg/mL的葡萄糖溶液，分別于0、30、60、120 min，剪尾取血，用血糖儀和血糖試紙測定各時間點血糖濃度，并計算血糖-時間曲線下面積(AUC)。(3)肝系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)：稱取體質(zhì)量后處死大鼠，剖取肝和腎周脂肪，稱質(zhì)量。分別以肝和腎周脂肪與體質(zhì)量的比值作為肝系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)，比較各組大鼠的肝系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)大小。(4)骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測：處死大鼠后，立即取大鼠右側(cè)股骨，剔除附著之肌肉、筋膜(保留骨膜)，生理鹽水沖洗，以生理鹽水浸潤的醫(yī)用紗布包裹，錫紙包于其外，立即或者在-20 ℃冰箱凍存后，在生物力學(xué)試驗機上進行骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測。

2.4　統(tǒng)計學(xué)分析

3結(jié)果

3.1　黃芪散對模型大鼠血糖、血脂的影響

與正常組比較，模型組FPG、TC、TG、LDL-C均顯著升高(P<0.01)(見表1)，表明T2DM大鼠造模成功。與模型組相比，黃芪散在第7周和第12周均能顯著降低模型大鼠FPG、TC、TG(見表1)(P<0.01,P<0.05)，說明黃芪散能調(diào)節(jié)模型大鼠的糖脂代謝，且藥效穩(wěn)定。

3.2 黃芪散對T2DM模型大鼠胰島素敏感性的影響

OGTT實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組在灌服葡萄糖溶液后的0、30、60、120 min 4個時間點的血糖和AUC均顯著升高(P<0.01)，提示胰島素抵抗。跟模型組相比，黃芪散能顯著降低各個時間點的血糖，降低AUC(P<0.01)，說明黃芪散能提高T2DM模型大鼠的敏感性，改善胰島素抵抗。見表2。

表1對T2DM模型大鼠血糖血脂的影響

與正常組比較： △△ P<0.01；與模型組比較： ** P<0.01。

與正常組比較：ΔΔP<0.01；與模型組比較：**P<0.01。

3.3　黃芪散對T2DM模型大鼠FINS的影響

與正常組相比，模型組大鼠在FPG顯著升高的同時(見表1)，F(xiàn)INS也顯著升高(P<0.01)(見表3)，這是胰島素抵抗的典型表現(xiàn)。而黃芪散在降低FPG的同時(見表1)，能顯著降低模型大鼠的FINS(P<0.01)(見表3)。

3.4黃芪散對T2DM模型大鼠體質(zhì)量、肝系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)的影響

經(jīng)過12周的高脂飼料誘導(dǎo)，模型組大鼠的體質(zhì)量顯著升高(P<0.01),肝系數(shù)顯著增大(P<0.01),并出現(xiàn)肉眼可見的脂肪肝，腎周脂肪系數(shù)顯著增大(P<0.01)(見表3)。黃芪散能降低T2DM模型大鼠的體質(zhì)量，降低肝系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)(P<0.01,P<0.05)。

表3黃芪散對T2DM模型大鼠體質(zhì)量、肝系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)、FINS的影響

組別劑量(g·kg-1)體質(zhì)量/g肝系數(shù)腎周脂肪系數(shù)FINS/(mU·L-1)正常組-466.79±54.212.73±0.181.63±0.3613.53±2.11模型組-578.13±53.03△△4.54±0.63△△2.26±0.53△△31.57±2.90△△黃芪散組2.96513.80±48.44*3.78±0.23**1.75±0.36*21.69±1.28**

與正常組比較：ΔΔP<0.01,與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

3.5黃芪散對T2DM模型大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型大鼠骨的最大載荷減少(P<0.05)(見圖1A)、最大吸收能力降低(P<0.01)(見圖1B)、結(jié)構(gòu)硬度減少(P<0.05)(見圖1C)。黃芪散能提高T2DM模型大鼠骨的最大載荷和最大吸收能量，改善骨生物力學(xué)指標(biāo)(P<0.01)。

與正常組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型組比較：**P<0.01。

圖1黃芪散對T2DM模型大鼠骨最大載荷(A)、最大吸收能力(B)及結(jié)構(gòu)硬度(C)的影響

Figure 1Effect of HQS on the maximum load (A),maximum energy absorption (B) and structural rigidity (C) of femur in T2DM rats

4討論

T2DM是一種多病因的代謝疾病，特點是慢性高血糖伴隨因胰島素分泌及作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。胰島素抵抗貫穿其發(fā)生、發(fā)展的全過程。本研究結(jié)果顯示，一次性低劑量STZ合并高脂飼料誘導(dǎo)所制備的T2DM大鼠模型，體質(zhì)量、肝系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)增加，具有肥胖、高血糖、高血脂、高空腹血漿胰島素的表型，較好地模擬了現(xiàn)代人類T2DM癥狀和發(fā)病機制，是考察抗T2DM藥物藥效的理想模型。

跟以往采用正常小鼠、T2DM小鼠和內(nèi)、外源性脂代謝異常大鼠模型[5-6]不同，本研究采用低劑量STZ+高脂飼料誘導(dǎo)的T2DM大鼠，再次證明黃芪散有降低血糖、血脂的藥效作用，能提高胰島素敏感性。此外，本研究還首次報道了黃芪散對T2DM大鼠模型骨的影響。

糖尿病常伴骨質(zhì)疏松癥[9],糖尿病及其所致的代謝紊亂可通過不同的環(huán)節(jié)影響骨代謝的過程。隨著對脂肪、胰腺與骨骼之間內(nèi)分泌代謝平衡的深入研究，目前形成了一些新的學(xué)說或觀點，如“骨-胰環(huán)”學(xué)說[10]，“脂-胰軸”學(xué)說[11]。在這些學(xué)說中，“骨”的功能逐漸被了解，骨除了承擔(dān)機體負(fù)重的作用之外，更重要的是作為一個真實存在的內(nèi)分泌器官參與了調(diào)節(jié)機體能量的轉(zhuǎn)化與代謝。脂肪、胰腺、骨骼三者在這個內(nèi)分泌環(huán)中彼此相關(guān)影響[11]。脂肪組織通過分泌瘦素對骨量有外周和中樞的效應(yīng)，外周效應(yīng)表現(xiàn)為瘦素增加成骨細(xì)胞增殖和分化，抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成脂轉(zhuǎn)化，中樞效應(yīng)表現(xiàn)為瘦素通過交感神經(jīng)系統(tǒng)抑制成骨細(xì)胞分化和羧化不全骨鈣素產(chǎn)生[11-12]。胰腺分泌胰島素信號作用于成骨細(xì)胞，促進成骨細(xì)胞分化及出生后的骨量獲得，同時刺激骨中羧化不全骨鈣素的分泌，而羧化不全骨鈣素作為一種荷爾蒙可反饋性地調(diào)節(jié)胰島素敏感性，從而影響體內(nèi)葡萄糖代謝及能量平衡[10]。骨質(zhì)疏松的主要危害是骨折，骨生物力學(xué)是骨量和骨結(jié)構(gòu)的綜合反映，直接反映骨組織的抗骨折能力，因此美國FDA要求動物模型要進行骨生物力學(xué)指標(biāo)的測定，以評價骨強度和其發(fā)展為脆性骨折的可能性。

本研究結(jié)果顯示，本實驗所復(fù)制的T2DM大鼠模型骨生物力學(xué)指標(biāo)表現(xiàn)異常，黃芪散在改善T2DM模型大鼠糖脂代謝、提高胰島素敏感性的同時，能在一定程度上逆轉(zhuǎn)肥胖、高血糖和胰島素抵抗給骨代謝帶來的影響，降低了骨折的風(fēng)險，并可能通過改善胰島素敏感性預(yù)防糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。但其對T2DM模型大鼠骨代謝其他方面的影響有待于進一步的研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)