HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定益心舒片中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量

付娟1,2，李家春1,2，張海弢1,2，殷洪梅1,2，黃文哲1,2，王振中1,2，蕭偉1,2

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001； 2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

摘要:目的 建立HPLC-ELSD 法測(cè)定益心舒片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。方法 采用Kromasil C18色譜柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水梯度洗脫，流速為1.5 mL·min`(-1)，柱溫為25 ℃；采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，漂移管溫度40 ℃，載氣N2，壓力3.500×10`5 Pa。結(jié)果 人參皂苷 Rg1、Re、Rb1 分別在進(jìn)樣量為0.757 5～12.12 μg、0.593 8～9.500 μg、0.580 6～9.290 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。3種人參皂苷的平均回收率分別為101.0% (RSD=0.543 6%)、98.99% (RSD=1.108%)、103.8%(RSD=0.467 2%)。結(jié)論 本方法靈敏度高、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于益心舒片中人參皂苷的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞:HPLC-ELSD 法； 益心舒片； 人參皂苷Rg1； 人參皂苷Re； 人參皂苷Rb1

中圖分類(lèi)號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.014

文章編號(hào):1006-8783(2015)01-0062-04

Abstract:Objective To establish an HPLC-ELSD method for the determination of ginsenoside Rg1,Re and Rb1 in Yixinshu tablets．Methods The Kromasil C18 column was used with a mobile phase of acetonitrile-water by gradient elution. The flow rate was 1.5 mL·min`(-1),and the column temperature was 25 ℃．An evaporative light scattering detector(ELSD) was used at drift tube temperature of 40 ℃ and gas pressure of 3.500×10`5 Pa.Results The linear range of ginsenoside Rg1,Re and Rb1 were 0.757 5-12.12 μg,0.593 8-9.500 μg and 0.580 6-9.290 μg,respectively. The average recoveries were 101.0% with RSD of 0.543 6%,98.99% with RSD of 1.108%,and 103.8% with RSD of 0.467 2%．Conclusion The method is sensitive,simple and repeatable．It could be used for the quality control of Yixinshu tablets．

收稿日期：2014-11-02

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)(2013ZX09402203)

作者簡(jiǎn)介：付娟(1987—)，助理研究員，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究， Email:jsfujuan@163.com；通信作者：蕭偉(1959—)，男，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，從事中藥新藥的研究與開(kāi)發(fā)，電話(huà)：0518-81152337，Email：wzhzh-nj@163.net。

Simultaneous determination of ginsenoside Rg1,Re and Rb1in Yixinshu tablets by HPLC-ELSD

FU Juan1,2，LI Jiachun1,2，ZHANG Haitao1,2，YIN Hongmei1,2，HUANG Wenzhe1,2，WANG Zhenzhong1,2，XIAO Wei1,2

( 1.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.Ltd,Lianyungang222001,China;2.StateKeyLaboratoryof

New-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,Lianyungang222001,China)

Key words:HPLC-ELSD; Yixinshu tablets; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13 8:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150113.0843.002.html

益心舒片由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎和山楂7味藥組成，其中人參、丹參為君藥，黃芪、麥冬、川芎為臣藥，山楂、五味子為佐藥。主要用于氣陰兩虛，心悸脈結(jié)代，胸悶不舒、胸痛及冠心病、心絞痛見(jiàn)上述癥狀者[1]。在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)人參進(jìn)行薄層鑒別，為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，擬對(duì)其君藥人參進(jìn)行質(zhì)量控制。

目前，測(cè)定人參皂苷的常用方法包括薄層掃描法[2-3]、HPLC-UV法[4]370,[5-6]、HPLC-ELSD法[7-8]等，還有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC-UV法測(cè)定益心舒膠囊中人參皂苷Rg1、Re的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[4]1022。人參皂苷類(lèi)成分多為末端吸收，使用紫外低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)基線(xiàn)易漂移，微量雜質(zhì)的干擾大而且分析時(shí)間較長(zhǎng)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種通用型檢測(cè)器，可以用于皂苷類(lèi)、萜類(lèi)內(nèi)酯等紫外末端吸收成分的分析[9]。為了更好控制益心舒片制劑的質(zhì)量，本研究建立了HPLC-ELSD法測(cè)定益心舒片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1儀器與試藥

Ultimate 3000型高效液相色譜儀(Thermo Fisher公司，SEDEX80 LT-ELSD檢測(cè)器)，BP211D、XP6型電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)。

人參皂苷Rg1、Re、Rb1均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院(批號(hào)分別為110703-201128、110754-200822、110704-201122)，益心舒片(批號(hào)：120210、120213、120216、120401、120406、120409，0.4 g·片-1)由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(4. 6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序?yàn)?～20 min，20%A；20～28 min，20%A～28%A；28～45 min， 28%A～36%A；45～50 min，36%A～65%A；50～55 min，65%A；流速為1.5 mL·min-1，柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件：漂移管溫度40 ℃，載氣N2，壓力3.500×105Pa，進(jìn)樣量10 μL。

2.2　混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、Re及Rb1對(duì)照品各適量，用甲醇溶解，配制成人參皂苷Rg1、Re及Rb1質(zhì)量濃度分別為1.212、0.950、0.929 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3　供試品溶液的制備

取益心舒片20片，去除薄膜衣，研細(xì)，取約3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中。精密加入70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)處理40 min。取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻、濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干。殘?jiān)盟?5 mL溶解，用水飽和的正丁醇分別萃取3次(30、30、20 mL)。合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，棄去氨試液，正丁醇液濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，搖勻、濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4　陰性對(duì)照溶液的制備

取處方組成中除人參外的其余成分制成不含人參的陰性對(duì)照樣品，按“2.3”項(xiàng)下制備方法處理得陰性對(duì)照溶液。

2.5　專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別精密吸取人參皂苷Rg1、Re、Rb1混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明供試品色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品主峰保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的理論塔板數(shù)均不低于7 000，拖尾因子均為1.02，與相鄰未知色譜峰的分離度均大于1.5 。結(jié)果表明本方法有良好的專(zhuān)屬性。見(jiàn)圖1。

1.人參皂苷Rg1； 2. 人參皂苷Re； 3.人參皂苷Rb1。

圖1混合對(duì)照品(A)、供試品(B)、陰性對(duì)照(C)溶液的HPLC-ELSD色譜圖

Figure 1HPLC-ELSD chromatograms of mixed references(A),sample(B) and negative control(C)

2.6　線(xiàn)性關(guān)系的考察

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以甲醇稀釋?zhuān)瑩u勻，制得系列對(duì)照品溶液，使人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度依次為75.75、151.5、303.0、606.0、1 212.0 μg·mL-1，人參皂苷Re質(zhì)量濃度依次為59.38、118.8、237.5、475.0、950.0 μg·mL-1，人參皂苷 Rb1質(zhì)量濃度依次為58.06、116.1、232.3、464.5、929.0 μg ·mL-1。分別精密吸取上述溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果人參皂苷Rg1回歸方程為Y=1.698 4X-3.463 8 (r=0.999 5)，人參皂苷Re回歸方程為Y=1.630 4X-2.991 5(r=0.999 6)，人參皂苷Rb1回歸方程為Y=1.651 4X-3.026 1(r=0.999 5)。人參皂苷 Rg1、Re、Rb1分別在進(jìn)樣量為0.757 5～12.12 μg、0.593 8～9.500 μg、0.580 6～9.290 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.7　精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液(人參皂苷Rg1、Re、Rb1質(zhì)量濃度分別為606.0、475.0、464.5 μg·mL-1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算得到Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD值分別為1.231%、1.642%、0.851%，表明儀器精密度良好。

2.8　重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批益心舒片(批號(hào)：120210)，共6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果Rg1、Re、Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.401 6%、0.484 9%、0.583 7%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.9　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批益心舒片(批號(hào)：120210)，約3 g，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、12 h進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定3種成分的峰面積。結(jié)果Rg1、Re、Rb1峰面積RSD值分別為1.643%、1.662%、1.701%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10　回收率試驗(yàn)

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(批號(hào)：120210，人參皂苷Rg1、Re、Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.629 1、1.327、1.941 mg·g-1)的益心舒片1.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(Rg1、Re、Rb質(zhì)量濃度分別為1.050、2.180、3.320 mg·mL-1)1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算3種成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

2.11　樣品測(cè)定

取6批益心舒片，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行操作2份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測(cè)得批號(hào)為120210、120213、120216、120401、120406、120409的益心舒片中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.629 1、0.649 4、0.660 3、0.635 3、0.592 4、0.582 1 mg·g-1，RSD值為4.99%；Re質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.327、1.326、1.316、1.345、1.292、1.269 mg·g-1，RSD值為2.09%；Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.941、1.812、1.873、1.795、1.791、1.781 mg·g-1，RSD值為3.42%。

表1益心舒片中人參皂苷Rg1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 1Recovery test results of ginsenoside Rg1in Yixinshu tablets(n=6)

編號(hào)樣品量/g樣品中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%11.6491.0371.0502.096100.921.6501.0381.0502.094100.631.6501.0381.0502.102101.341.6501.0381.0502.102101.351.6451.0351.0502.101101.561.6401.0321.0502.083100.1平均回收率=101.0%;RSD=0.5436%

表2益心舒片中人參皂苷Re加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 2Recovery test results of ginsenoside Re in Yixinshu tablets(n=6)

編號(hào)樣品量/g樣品中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%11.6492.1892.1804.35099.1321.6502.1892.1804.370100.031.6502.1892.1804.32597.9841.6502.1892.1804.34198.7251.6452.1832.1804.31297.6661.6402.1762.1804.365100.4平均回收率=98.99%;RSD=1.108%

表3益心舒片中人參皂苷Rb1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 3Recovery test results of ginsenoside Rb1in Yixinshu Tablets(n=6)

編號(hào)樣品量/g樣品中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%11.6493.2013.3206.657104.121.6503.2023.3206.668104.431.6503.2023.3206.632103.341.6503.2023.3206.655104.051.6453.1933.3206.636103.761.6403.1833.3206.607103.1平均回收率=103.8%;RSD=0.4672%

3討論

3.1　色譜條件的考察

比較了乙腈-水不同梯度洗脫條件下人參皂苷Rg1、Re和Rb1的分離效果，結(jié)果采用文中洗脫程序時(shí)人參皂苷Rg1、Re和Rb1與鄰近色譜峰的分離效果更好。同時(shí)考察了不同流速(1.0、1.2、1.5 mL·min-1)、不同柱溫(20、25、30、35 ℃)、不同色譜柱(Phenomenex Luna C18、Waterts Symmetry C18、Kromasil C18)的分離效果，結(jié)果表明流速為1.0、1.2 mL·min-1時(shí)，供試品溶液中人參皂苷Rg1和Re 2個(gè)色譜峰未分開(kāi)，故選用流速1.5 mL·min-1；不同柱溫、不同色譜柱對(duì)人參皂苷Rg1、Re和Rb1分離度無(wú)明顯影響。

3.2　供試品處理方法的考察

以Rg1、Re 和Rb1的提取率為指標(biāo)，考察了提取溶劑(甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇)、提取方式(超聲處理和回流提取)、提取溶媒體積(50、100、200 mL)、提取時(shí)間(30、40、60 min)以及水飽和正丁醇的不同萃取次數(shù)(3、4、5次)的提取效果，結(jié)果表明采用70%乙醇100 mL超聲處理40 min，水飽和正丁醇液萃取3次效果較好?？疾彀痹囈合礈鞂?duì)供試品提取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氨試液處理過(guò)的供試品溶液中Rg1、Re 和Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有增加，可能是堿性環(huán)境能夠促進(jìn)人參皂苷成分的溶出[10]，具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

益心舒片中人參為君藥，皂苷類(lèi)成分為人參的特征性成分， 2010年版《中國(guó)藥典》中人參藥材主要測(cè)定人參皂苷Rg1、Re 和Rb1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本文所建立方法的分析時(shí)間與之相比大大縮短，且能使益心舒片制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)與其藥理作用相互對(duì)應(yīng)，提高了質(zhì)量評(píng)價(jià)的針對(duì)性。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)