束花石斛降血糖活性及化學(xué)成分研究

倪俊，蔡金艷，黃楚君，呂華沖，陳天洪

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 研究蘭科石斛屬植物束花石斛Dendrobium chrysanthum Lindl.各部位的降血糖活性及活性部位的化學(xué)成分。方法 采用胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型篩選束花石斛降血糖活性部位，并應(yīng)用多種柱色譜及重結(jié)晶的方法對活性部位進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果 加藥質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，三氯甲烷部位的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量達(dá)到了模型組的442.4%，細(xì)胞存活數(shù)為模型組的62.9%。從三氯甲烷部位分離并鑒定了10個化合物，分別鑒定為β-谷甾醇(1)，moscatin(2)，對羥基反式肉桂酸三十烷基酯(3)，1,3,5-三甲氧基苯(4)，isonuatigentin(5)，香豆素(6)，2,4,7-三羥基-5-甲氧基-9-芴酮(7)，大黃素甲醚(8)，丁香酸(9)，胡蘿卜苷(10)。結(jié)論 綜合考慮降血糖活性及對細(xì)胞的毒性，束花石斛三氯甲烷部位活性優(yōu)于其他部位，其中化合物2～6、9為首次從該植物中分離得到，化合物4、5為首次從該屬植物中分離得到。

關(guān)鍵詞:束花石斛； 降血糖活性； 化學(xué)成分； HepG2

中圖分類號:R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.003

文章編號:1006-8783(2015)01-0010-04

Abstract:Objective To study the hypoglycemic activity of Dendrobium chrysanthum Lindl. and chemical constituents from the active part. Methods Insulin resistant HepG2 cells were used to evaluate the hypoglycemic activity and several chromatographic methods were applied to isolate and purify compounds. The structures were identified on the basis of physicochemical properties and spectroscopic data. Results The glucose consumption and survival cells of 2.0 mg/mL of chloroform extract were 442.4% and 62.9% to model group. Ten compounds were isolated and identified as β-sitosterol(1),moscatin(2),defusine(3),1,3,5-trimethoxybenzene(4),isonuatigentin(5),coumarin(6),2,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone(7),physcion(8),syringic acid(9),daucosterol(10).Conclusion The chloroform extract showed significant hypoglycemic activity in HepG2 cells. Compounds 2～6 and 9 were isolated from Dendrobium chrysanthum Lindl. for the first time,and compounds 4 and 5 were isolated from the genus for the first time.

收稿日期：2014-11-12

基金項目：2014年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目；2014年學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技項目；國家自然科學(xué)基金項目(81001628)；廣東省自然科學(xué)基金項目(S2013010014771)；廣州市珠江科技新星專項

作者簡介：倪俊(1990—)，男，2012級碩士研究生，Email：972213754@qq.com;通信作者：蔡金艷，女，副教授，主要從事天然藥物活性成分和創(chuàng)新藥物研究，Email:caijy928@163.com。

Study on hypoglycemic activity and chemical constituents fromDendrobiumchrysanthumLindl.

NI Jun,CAI Jinyan,HUANG Chujun,LYU Huachong,CHEN Tianhong

(SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Key words:DendrobiumchrysanthumLindl.; hypoglycemic activity; chemical constituents; HepG2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-01-13 14:57網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150113.1457.005.html

蘭科植物石斛(DendrobiumnobileLindl.)是一種歷史悠久的常用珍貴中藥，藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[2-3]。2010年版《中國藥典》記載，石斛可用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨疲軟[4]。研究表明石斛降血糖效果明顯[5]。束花石斛(DendrobiumchrysanthumLindl.)是蘭科石斛屬的一種植物[6]，分布于廣西、貴州、云南等地，莖可用于陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱、目暗不明等。目前，關(guān)于束花石斛的研究較少。已報道其化學(xué)成分主要包括菲類、聯(lián)芐類及蒽醌類等[7]。

在高水平的胰島素條件下，HepG2細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)[8]，因此,HepG2是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想細(xì)胞模型[9]。本文采用胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型篩選了束花石斛三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的降血糖效果，結(jié)果表明三氯甲烷部位的降血糖效果較好，且細(xì)胞毒性較小，進(jìn)一步從三氯甲烷部位分離鑒定了10個化合物。

1儀器與試劑

BioRAD model680酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；Thermo model3111二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超凈臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；Thermo CR3i離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Leica DFC420倒置顯微鏡(德國Lecia公司)；X-5數(shù)字顯示顯微熔點儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)；BrukerAV-500兆核磁共振儀(德國Bruker公司)；ZF-20C暗箱紫外分析儀(上海壘固儀器有限公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare公司)。

HepG2細(xì)胞由中山大學(xué)法學(xué)院研究所提供；結(jié)晶牛胰島素、MTT(Sigma公司)；含酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為25 mmol/L)；胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液、青-鏈霉素混合液(雙抗，Hyclone公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；葡萄糖試劑盒(中深百控生物科技有限公司)；高效GF254硅膠薄層板、柱色譜硅膠(200～300目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

2方法

2.1　提取分離

束花石斛干燥莖7.5 kg，經(jīng)剪碎后用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流提取4次，每次3 h，濾過，合并濾液，回收乙醇得總浸膏550 g，將總浸膏加適量的水溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取部位濃縮成浸膏，得到石油醚部位90 g，三氯甲烷部位170 g，乙酸乙酯部位75 g，正丁醇部位160 g。將三氯甲烷部位樣品(170 g)，經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，TLC檢識，合并相同組分，得到各組分再反復(fù)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜及溶劑(石油醚、乙酸乙酯)重結(jié)晶純化，得到化合物1(100 mg)、化合物2(100 mg)、化合物3(30 mg)、化合物4(25 mg)、化合物5(25 mg)、化合物6(25 mg)、化合物7(30 mg)、化合物8(45 mg)、化合物9(25 mg)、化合物10(200 mg)。

2.2　降血糖活性篩選

用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為105個/mL，轉(zhuǎn)入96孔板中。待細(xì)胞單層貼壁后，加入新配制的含有10-7mol/L胰島素的培養(yǎng)液，并設(shè)無胰島素的空白孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，分別設(shè)空白對照組、胰島素抵抗模型組、二甲雙胍組、束花石斛各部位處理組(終質(zhì)量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL)。在藥物處理24 h后檢測培養(yǎng)基上清的葡萄糖質(zhì)量及細(xì)胞存活量，計算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量及細(xì)胞活力[10]。

3結(jié)果

3.1各部位對胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和細(xì)胞活力試驗結(jié)果

從表1可見：加藥組與模型組比較，束花石斛各部位的浸膏都能夠促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗；三氯甲烷部位的葡萄糖消耗隨著藥物質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，藥物質(zhì)量濃度在2.0 mg/mL時，葡萄糖消耗量達(dá)到模型組的442.4%；正丁醇部位在0.0625～2.0 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖消耗隨著藥物質(zhì)量濃度的增大而先增大后減小，在0.5 mg/mL時，葡萄糖消耗量達(dá)到最大；乙酸乙酯部位的葡萄糖消耗量較三氯甲烷和正丁醇部位少，活性隨藥物質(zhì)量濃度的變化改變不明顯。

從表2可見：束花石斛加藥組最終細(xì)胞存活數(shù)較正常組和模型組都有所降低，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時，三氯甲烷部位的細(xì)胞存活數(shù)為模型組的62.9%，而乙酸乙酯及正丁醇部位的存活數(shù)僅為模型組的14.5%及31.4%，表明三氯甲烷部位的細(xì)胞毒性較低。

綜合束花石斛各部位葡萄糖消耗和對細(xì)胞存活影響作用的結(jié)果，三氯甲烷部位葡萄糖消耗隨藥物質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，且在高質(zhì)量濃度時細(xì)胞毒性較小，所以三氯甲烷部位有較大的研究價值和前景，預(yù)期可在該部位找到降血糖作用明確且對細(xì)胞毒性小的單體化合物。

表1　束花石斛各部位對胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量

與模型組比較： * P<0.05。

與模型組比較：*P<0.05。

3.2　化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 138～140 ℃，與β-谷甾醇共薄層，兩者混合熔點不下降，故確定化合物1為β-谷甾醇。

化合物2：無色結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：4.09(3H，s，4-OCH3)，6.85(1H，d，J=2.5 Hz，3-H)，6.99(1H，d，J=2.5 Hz，2-H)，7.25(1H，d，J=1.5 Hz，8-H)，7.44(1H，dd，J=8.5，1.5 Hz，6-H)，7.45(1H，dd，J=8.5，1.5 Hz，7-H)，7.50(1H，t，J=8.5 Hz，10-H)，7.64(1H，d，J=8.5 Hz，9-H)，9.64(1H，s，5-OH)；根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[11]，確定化合物2為moscatin。

化合物3：白色粉末(石油醚-乙酸乙酯)，mp 75～77 ℃；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：7.63(1H，d，J=16.0 Hz，β-H)，6.31(1H，d，J=16.0 Hz)，7.43(2H，d，J=8.5 Hz，2，6-H)，6.85(2H，d，J=8.5 Hz，3，5-H)，4.19(2H，t，J=7.0 Hz，O—CH2)，0.88(3H，t，J=6.5 Hz，—CH3)；根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[12]，確定化合物3為對羥基反式肉桂酸三十烷基酯。

化合物4：黃色針晶(石油醚-乙酸乙酯)；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：5.86(3H，s，H-2，4，6)，3.83(9H，s，CH3O-1，3，5)；13C-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：156.87(C-1，3，5)，106.97(C-2，4，6)，56.03(—OCH3-1，3，5)；結(jié)合以上光譜數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)[13]，鑒定化合物4為1，3，5-三甲氧基苯。

化合物5：白色粉末；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：5.36(1H，m)，3.75(1H，d)，3.27(1H，dd)，1.13(3H，s)，1.04(6H，t)，0.81(3H，s)；13C-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：14.6，16.5，19.5，21.0，24.9，27.2，29.9，31.6，31.8，31.9，32.2，32.9，36.8，37.4，39.9，40.5，41.7，42.4，50.2，56.7，62.0，66.9，69.2，71.9，81.6，109.3，121.5，141.0；以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]一致，確定化合物5為isonuatigentin。

化合物6：白色針晶，mp 64～65 ℃；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：7.72(1H，d，J=9.5 Hz，4-H)，7.54(1H，ddd，J=7.5，8.5，1.5 Hz，7-H)，7.49(1H，d，J=7.5，1.5 Hz，5-H)，7.35(1H，d，J=8.5 Hz，8-H)，7.29(1H，ddd，J=7.5，8.5，1.5 Hz，6-H)，6.44(1H，d，J=9.5 Hz，3-H)；13C-NMR(500 MHz)δ：161.0(2-C)，154.3(9-C)，143.6(4-C)，132.0(7-C)，128.0(5-C)，124.6(6-C)，119.0(10-C)，117.1(8-C)，117.0(3-C)；綜合以上數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[15]對比，確定化合物6為香豆素。

化合物7：黑紅色結(jié)晶；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：3.99(3H，s)，6.30(1H，d，J=2.0 Hz)，6.56(1H，d，J=2.0 Hz)，6.61(1H，d，J=2.0 Hz)，6.67(1H，d，J=2.0 Hz)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]一致，確定化合物7為2,4,7-三羥基-5-甲氧基-9-芴酮。

化合物8：黃色針晶(石油醚-乙酸乙酯)；1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：12.31(1H，s，—OH)，12.12(1H，s，—OH)，7.62(1H，d，J=1.5 Hz，5-H)，7.36(1H，d，J=2.5 Hz，4-H)，7.08(1H，d，J=1.0 Hz，7-H)， 6.68(1H，d，J=2.5 Hz，2-H)，3.94(3H， s，—OCH3)，2.45(3H，s，—CH3)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]一致，確定化合物8為大黃素甲醚。

化合物9：白色結(jié)晶，1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：7.33(1H，s)，3.89(3H，s)，確定化合物9為丁香酸[17]。

化合物10：白色粉末，與胡蘿卜苷對照品共薄層，兩者混合熔點不下降，確定化合物10為胡蘿卜苷。

4結(jié)論

本文通過胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞模型研究了束花石斛各部位的降血糖活性，篩選得到三氯甲烷部位的降血糖活性較明顯且細(xì)胞毒性較小；從三氯甲烷部位分離鑒定了10個化合物，其中6個化合物為首次從該植物中分離得到，2個為首次從該屬植物中分離得到，這些化合物的降血糖活性還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 李旻，劉友平，張玲，等.石斛屬藥用植物研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23(5)：74-76.

[2] 張紀(jì)立，何錦麗.石斛藥理研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2000，11(5)：469-470.

[3] 張光濃，畢志明，王崢濤，等.石斛屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥，2003，34(6)：5-8.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：265-266.

[5] 吳昊姝，徐建華，陳立鉆，等.鐵皮石斛降血糖作用及其機(jī)制的研究[J].中國中藥雜志，2004，29(2)：160-163.

[6] 李瑋，邵進(jìn)明，雷戰(zhàn)霞，等.流蘇石斛與束花石斛揮發(fā)油成分[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(9)：55-58.

[7] 楊莉，王云，畢志明，等.束花石斛化學(xué)成分研究[J].中國天然藥物，2004，2(5)：280-282.

[8] LEVY J R,BELSKY M. Down-regulated insulin receptors in HepG2 cells have an altered intracellular itinerary[J].Am J Med Sci,1990,299(5):302-308.

[9] DHANANJAY G,SHALIIY V,RAMJI L K. Long-term effects of tumor necrosis factor-a treatment on insulin sigalling pathway in HepG2 cells and HepG2 cells overexpressing constitutively active Akt/PKB[J].J Cell Biochem，2007,100(3):593-607.

[10] 韋乃球，冼寒梅，楊柯，等.白子菜對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗改善作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22(6)：1395-1396.

[11] 秦海林，張建新，王崢濤，等.環(huán)草石斛的1H-NMR指紋圖譜解析[J].中國中藥雜志，2002(27)：919-923.

[12] 王敏，張朝鳳，王崢濤，等.杯鞘石斛化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2007(32)：701-703.

[13] 黃鷹，常睿潔，金慧子，等.觀光木酚性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012(24)：176-178.

[14] REIKO S,CHIAKI F,KOTARO M，et al.Two steroidal glycosides,aculeatiside A and B fromSolanumaculeatissimum[J]. Phytochemistry,1983,2(3):733-736.

[15] 莫順燕，楊永春，石建功.桑黃化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2003，28(4)：339-341.

[16] YANG Hong,CHOU Guixin,WANG Zhengtao,et al. Two new fluorenones fromDendrobiumchrysotoxum[J].J Asian Nat Prod Res,2004,6(1):35-38.

[17] 李燕.鐵皮石斛化學(xué)成分研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2009.

(責(zé)任編輯：陳翔)