黃麗萍　燕波　侯敏　孫夢盛　何堃　官揚　姚麗華　周茂福

[摘要]該研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法，將阿爾茨海默病的關鍵靶點與二至丸化合物進行分子對接，通過Cytoscape 321 軟件，建立成分靶點、靶點信號通路網(wǎng)絡模型進行網(wǎng)絡分析，探討二至丸防治阿爾茨海默病的物質(zhì)基礎與作用機制。模擬篩選出來的30個化合物與阿爾茨海默病關鍵靶點及靶點集中所在的Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3條信號通路均有很強的相互作用，其中有槲皮素、香葉醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚5個成分可通過文獻驗證，初步揭示了二至丸防治阿爾茨海默病的物質(zhì)基礎及其在3條信號通路上的作用機制。通過網(wǎng)絡藥理學方法發(fā)現(xiàn)，二至丸防治阿爾茨海默病的活性成分可能是槲皮素、香葉醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚，其作用機制可能與Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3條信號通路有關。

[關鍵詞]網(wǎng)絡藥理學； 分子對接； 二至丸； 阿爾茨海默病

[Abstract]The present study is to explore the material basis and mechanism of Erzhi Wan the prevented Alzheimer′s disease by using network pharmacology The key target of Alzheimer′s disease was docked with the Erzhi Wan compounds， and the drugstarget combined with targetsignal pathway network model was established by Cytoscape 321 software Thirty compounds have a strong interaction with key target of Alzheimer′s disease and three key pathways related with Wnt， MAPK and PI3KAktmTOR There are 5 ingredients such as quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，eriodictyol that could be verified from literatureThis result initially revealed the material basis for Erzhi Wan for Alzheimer′s disease and the mechanism in terms of three signaling pathways The network pharmacology method found that the active ingredients of Erzhi Wan for Alzheimer′s disease may be quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，and eriodictyol， and the mechanism may be related to three signal pathways including Wnt， MAPK， and PI3KAktmTOR.

[Key word]network pharmacology； molecular docking； Erzhi Wan； Alzheimer′s disease

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）以進行性記憶和認知功能障礙為主要表現(xiàn)，其病理學特征表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）聚集形成老年斑（sennepfaques，SPs）、細胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結（neurofibrillarytangles，NFTs）和神經(jīng)元死亡[1]。隨著老齡化程度的加重，AD發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅老年人的生命安全，是繼心臟病、癌癥后的第3位死因，給家庭和社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔[2]?，F(xiàn)有藥物能在一定程度上控制、緩解AD癥狀，但治療效果不理想，因此尋找高效藥物以延緩、控制AD的發(fā)生和發(fā)展具有重要的社會意義。二至丸由女貞子（蒸）、墨旱蓮（1∶1）2味中藥組成，其藥理作用包括保肝、提高免疫力、益智、抗衰老、抗腫瘤抗炎作用[3]，但是二至丸防治AD的物質(zhì)基礎鮮有人研究，且其作用的機制尚不清楚。

作為中藥研究的學科前沿，網(wǎng)絡藥理學融合了系統(tǒng)生物學和多向藥理學的思想，被應用到生命科學的多個領域，如新藥靶的識別、先導化合物的發(fā)現(xiàn)、作用機制的研究、物質(zhì)基礎的篩選等[4]，以分子對接、藥物靶點網(wǎng)絡構建以及網(wǎng)絡特征分析為基礎的多靶點整體調(diào)控的思維方法，可進行中藥多成分與多靶點的對接、分析。因此，利用網(wǎng)絡藥理學的手段，探究二至丸防治AD的物質(zhì)基礎與作用機制，既有助于解決篩選物質(zhì)基礎時成本高及周期長的問題，也有助于解決探尋作用機制時單靶局限性問題，便于探究二至丸的主要活性成分群和靶標群，闡述二至丸物質(zhì)基礎和作用機制[5]。

1材料與方法

11材料

本研究應用的軟件為 DISCOVERY STUDIO中DS LibDock模塊和Cytoscape 321。軟件運行環(huán)境：Microsoft Windows 7 Home Basic操作系統(tǒng)。

12二至丸所含成分的收集

從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP）[6]以及二至丸的國內(nèi)外文獻調(diào)研，共收集得到二至丸167種（墨旱蓮48種、女貞子119種）化學成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載分子結構后，導入軟件DISCOVERY STUDIO進行三維結構轉換、加氫處理及Minimize能量優(yōu)化，結果保存為mol2文件格式。

13成分與關鍵蛋白對接endprint

通過對大量有關AD 發(fā)病機制文獻的調(diào)研，選擇了與AD發(fā)病機制相關的23 個靶蛋白 [7]，在PDB蛋白質(zhì)晶體結構數(shù)據(jù)庫搜索AchE，CaMKIIα，COX2等23個有復合晶體結構的關鍵靶點。利用DISCOVERY STUDIO對接軟件，刪除靶蛋白結構中的水分子，再加上極化的氫原子，賦予其正電荷，根據(jù)相關文獻報道，提取位于活性口袋位置的配體小分子，暴露受體的活性口袋。其他參數(shù)設置為缺省值。利用DISCOVERY STUDIO對接軟件，二至丸成分與23個靶蛋白進行柔性對接，其中打分函數(shù)選取的是LibDock Score打分函數(shù)。對接完成后，以LibDock Score 打分值為參考，篩選二至丸活性分子。

14分子對接評價方法

通過查閱相關文獻，選定Dock Score≥60 [8]作為二至丸活性分子與AD關鍵蛋白靶點是否存在較強結合活性的評價指標，為了排除不具備類藥性質(zhì)的分子，使用里賓斯基（Lipinski）類藥性五原則對Dock Score≥60的成分進行篩選。

15構建分子蛋白、蛋白通路作用網(wǎng)絡圖

相互作用網(wǎng)絡圖是指將彼此之間存在某種聯(lián)系的分子、靶蛋白、信號通路等分子用節(jié)點（node）表示，分子與靶蛋白、靶蛋白與信號通路之間的聯(lián)系用邊（edge）進行表示，構成的能夠顯示彼此之間相互作用關系的網(wǎng)絡圖。

為了更加清晰地闡明23個關鍵靶點與二至丸活性分子之間的關系及其集中所在的信號通路，利用軟件Cytoscape 321，以篩選所得化合物、AD關鍵蛋白靶點（至少與10個二至丸成分有較好的對接結果）、化合物所屬藥材及AD關鍵蛋白靶點、靶點所在信號通路作為材料，分別構建分子蛋白作用網(wǎng)絡圖和多線性組織結構型（多下屬對多上級、彼此之間協(xié)同作用）蛋白通路作用網(wǎng)絡圖，其中信號通路作為靶點歸屬成為節(jié)點參與蛋白通路網(wǎng)絡構建。運用Tools面板下的network analysis計算相關網(wǎng)絡拓撲參數(shù)。

2結果

21可靠性驗證

要驗證所選取的23個靶蛋白的復合晶體結構是否可靠，利用DISCOVERY STUDIO軟件，將原配體抽離出來，然后重新對接回復合物的活性口袋，對對接后配體的構象與原晶體結構中配體構象進行計算，得到的均方根偏差（RMSD）值得到小于2，證明該對接方法可靠，見表1 [9]。結果表明所選用的蛋白結構都比較可靠，可用于虛擬篩選。

22分子對接結果

通過篩選得到64個化合物，但這64個化合物作用的靶點數(shù)目不一，為了得到具有較高活性的化合物，選取作用靶蛋白數(shù)目≥5為指標，篩選出30個分子與5個或5個以上蛋白靶點有比較強烈的相互作用，23個分子與10個或10個以上蛋白靶點有強烈的相互作用，見表2，3。

23構建分子蛋白、蛋白通路作用網(wǎng)絡圖

根據(jù)對接篩選結果，利用Cytoscape 321軟件，構建分子蛋白作用網(wǎng)絡圖，見圖1。另外，發(fā)現(xiàn)除GLP1R外，其他22個關鍵靶點至少與10個二至丸成分有較好的對接結果。通過KEGG數(shù)據(jù)庫，查找22個關鍵靶點所涉及到的信號通路，為了找尋二至丸作用效果顯著的信號通路，設置參與信號通路的靶蛋白數(shù)≥3。匯總分析發(fā)現(xiàn)，至少有3個靶蛋白所在的信號通路有3條，分別是Wnt，MAPK，PI3KAktmTOR，見圖2。

23分子靶蛋白網(wǎng)絡特征分析

對分子靶蛋白網(wǎng)絡的總體特征分析表明：節(jié)點數(shù)目（number of nodes）為89，平均相鄰節(jié)點數(shù)（average number of neighbors）為9708，網(wǎng)絡度（network density）為0110，網(wǎng)絡中心度（network centralization）為0375，網(wǎng)絡異質(zhì)性（network heterogeneity）為0819。對靶蛋白信號通路網(wǎng)絡的總體特征分析表明：節(jié)點數(shù)目為13，平均相鄰節(jié)點數(shù)為1846，網(wǎng)絡度為0154，網(wǎng)絡中心度為0311，網(wǎng)絡異質(zhì)性為0700。結果顯示，二至丸分子靶蛋白網(wǎng)絡中既存在與β谷甾醇分子對TNFα，caspase7，CaMKIIδ，GSK3β，BchE等9個靶蛋白作用相似的1個分子對多個靶蛋白作用的現(xiàn)象，同時也存在與香葉醇、橙花醇、紅景天苷等27個分子對AchE 1個靶蛋白作用相似的不同分子作用于同一個靶蛋白的現(xiàn)象，并且

PI3KAktmTOR信號通路與MAPK激酶途徑、PI3KAktmTOR信號通路與非經(jīng)典Wnt信號通路分別以TNFα，GSK3β靶蛋白為紐帶聯(lián)系在一起而不是獨立分開的，這也正符合了中藥多組分、多靶點協(xié)同作用的特點。

3討論

31活性分子分析

結合分子對接結果和類藥性分析，最終篩選出30個至少與5個靶點蛋白的Dock Score≥60并符合Lipinski 類藥性五原則的分子，其中黃酮類有cosmetin，quercetin，3′Omethylorobol，taxifolin，eriodictyol，萜類有geraniol，betasitosterol，酚類有sinapyl alcohol，salidrosid，3，4dihydroxyphenylethyl alcohol glucoside，苯丙素類有coniferin，coniferol，烯醇類有nerol。對計算得到的二至丸與AD相關的有效物質(zhì)進行了文獻驗證，發(fā)現(xiàn)女貞子中的香葉醇[10]、β谷甾醇[11]、橙花醇[12]、圣草酚[13]以及2藥均有的槲皮素[14]均有相關文獻報道，證明了此研究方法的合理性。由于現(xiàn)階段對單體物質(zhì)防治AD的研究不多，導致對接結果所顯示的5個化合物并不包含墨旱蓮和女貞子的特征性成分，這也說明了中藥防治AD的前景廣闊性。

32作用機制分析

321MAPK激酶途徑MAPK是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號轉導胞外和胞內(nèi)的各種刺激引起細胞反應。這些反應包括細胞質(zhì)或細胞核靶蛋白的磷酸化從而激活轉錄因子，進而調(diào)節(jié)基因的表達。哺乳動物的MAPK家族包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、cJun氨基末端激酶（JNK）和p38蛋白激酶（p38 kinases）。由靶點信號通路網(wǎng)絡圖可知，與AD相關的靶蛋白TNFα，HSP70，caspase3主要集中在JNK通路，激活MAPK激酶可以調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、死亡和生存[15]。田允等[16]研究表明，女貞子可通過降低caspase3的表達，減少神經(jīng)元細胞的凋亡。李杰[17]的研究表明，槲皮素通過抑制p38MAPK磷酸化，阻斷JNK活化，保護神經(jīng)元細胞?？紫槌糩18]研究表明，槲皮素具有抑制熱休克蛋白HSP70生成的作用，并對細胞凋亡有一定的保護作用。根據(jù)對接結果，16個二至丸成分都作用于這一通路，說明其可能是二至丸可通過該信號通路改善阿爾茨海默病。endprint

322非經(jīng)典Wnt信號通路與經(jīng)典Wnt信號通路相比無β連環(huán)蛋白參與，而是其他一些離子（Ca2+）或蛋白的參與。目前研究較多的主要包括Wnt/ Ca2+通路和Wnt/PCP（planar cell polarity）通路。由靶點信號通路網(wǎng)絡圖可知，與AD相關的

靶蛋白CaMKⅡα，CaMKⅡβ，CaMKⅡγ，CaMKⅡδ，GSK3β主要集中在Wnt/Ca2+通路，Wnt/Ca2+通路主要通過Wnt，F(xiàn)z介導增加細胞內(nèi)的鈣離子濃度，激活蛋白激酶C和其他鈣離子依賴性蛋白激酶來發(fā)揮作用 [1920]。吳婷等[21]研究表明，槲皮素通過作用于Wnt信號通路，減輕炎癥反應，促進細胞存活，減輕神經(jīng)毒性，對神經(jīng)炎癥和癡呆癥有著一定的治療作用。根據(jù)對接結果，32個二至丸成分都作用于這一通路，說明二至丸可能通過該信號通路改善阿爾茨海默病。

323PI3KAktmTOR信號通路PI3K 家族，是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，是一類特異性的催化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）3位羥基磷酸化，產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，它與Akt 及其下游mTOR構成細胞內(nèi)一個新的信號轉導通路。在此信號轉導通路中，各種細胞因子可以使PI3K 活化，引起Akt 活化與細胞膜結合，在PI3K 依賴激酶（PI3Kdependentkinase，PDK） 的作用下，Akt 的絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化被激活，mTOR對Akt的負調(diào)節(jié)，可抑制Akt活性，在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，參與胞內(nèi)酶聯(lián)反應。與AD相關的靶蛋白TNFα，Bcl2，mTOR主要集中在PI3KAktmTOR信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、抗凋亡、細胞遷移、囊泡轉運等生物學過程[22]。屈嶺等[23]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過作用PI3KAktmTOR信號通路，誘導自噬而減少凋亡，促進細胞增殖。但對于現(xiàn)有文獻，未發(fā)現(xiàn)通過作用PI3KAktmTOR信號通路，而產(chǎn)生抗AD作用，但根據(jù)對接結果，35個二至丸成分都作用于這一通路，說明其可能是二至丸改善阿爾茨海默病的潛在信號通路。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，將分子計算、網(wǎng)絡分析、文本挖掘等組合起來，多靶點、多方位、多層次地對二至丸的化學成分、作用靶點和相關疾病信號通路進行了探索性研究。研究結果初步驗證了二至丸防治阿爾茨海默病的物質(zhì)基礎與作用機制，既體現(xiàn)了二至丸多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，也為進一步深入探討作用機制奠定了良好基礎。網(wǎng)絡藥理學作為一種新興的藥物研究手段，但還存在一定的局限性，若要將得出的結論應用于臨床，尚需要藥理實驗研究的驗證。同時，本研究未考慮藥物在制作過程中可能發(fā)生的化學反應對藥物成分造成的影響，也未考慮藥物配伍中劑量的選擇等，還需進一步深入研究探討。

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[責任編輯丁廣治]endprint