國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(GCX12012)

小單孢菌40027菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101的特性及其抗性標記

李曉華，楊振飛，李陽，陶新園，吳金龍，劉濤，陳鑫，梅楓，馬婷婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

摘要從稀有放線菌小單孢菌40027菌株中分離到2個內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101和pJTU112，用BamH I單酶切質(zhì)粒pJTU101確定其大小，通過同源片段之間發(fā)生單交換實現(xiàn)內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101的抗性標記，并對其穩(wěn)定性進行了初步研究.結(jié)果表明：小單孢菌40027菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101拷貝數(shù)為1～2，大小約為36.6 kb，被阿泊拉霉素抗性基因標記且在小單孢菌40027 菌株中比較穩(wěn)定.

關(guān)鍵詞小單孢菌40027菌株；質(zhì)粒pJTU101；抗性基因標記；穩(wěn)定性

作者簡介李曉華( 1968- )，男，教授，博士，研究方向：微生物學(xué)， E-mail：lixiaohua@mail.scuec.edu.cn

基金項目國家自然科學(xué)基金資助項目(31070087, 30570046)；湖北省自然科學(xué)基金重點項目(2011CDA079, 2008CDB076)；

中圖分類號Q933文獻標識碼A

The Characteristic and Resistance Marker of Plasmid

pJTU101 fromMicoromonosporasp.40027

LiXiaohua,YangZhenfei,LiYang,TaoXinyuan,WuJinlong,LiuTao,ChenXin,MeiFeng,MaTingting

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission，

College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

AbstractTwo plasmids, pJTU101 and pJTU112, were isolated from Micoromonospora sp. 40027. The size of plasmid pJTU101 was identified by BamH I restriction patterns and plasmid pJTU101 was labeled via single crossover between homologous fragments. The stability of pJTU101 was also studied. The results suggested that the plasmid pJTU101 with copy number of 1～2, which was about 36.6 kb, had high genetic stability with apramycin-resistant gene marker in Micoromonospora sp. 40027.

KeywordsMicoromonospora sp. 40027；plasmid pJTU101；resistance marker；genetic stability

小單孢菌是一類具有復(fù)雜生活史的稀有放線菌，屬于原核微生物，可產(chǎn)生多種重要的次級代謝產(chǎn)物[1,2].小單孢菌常見于水和土壤中，但主要生活在水生環(huán)境中[3,4].一些抗生素如慶大霉素、紫蘇霉素、福堤霉素A等是小單孢菌所產(chǎn)生的較為常見產(chǎn)物[5]，而且有些小單孢菌還能產(chǎn)生有效殺死腫瘤細胞的生物活性物質(zhì)，如從土壤和海洋中分離的小單孢菌可產(chǎn)生烯二炔類抗腫瘤抗生素，該藥物是強效抗腫瘤抗生素[6]. 雖然已有研究利用的物理和化學(xué)手段誘變小單孢菌40027菌種，提高了福堤要素A的產(chǎn)量[7],但目前關(guān)于小單孢菌質(zhì)粒的研究還很少，所分離獲得的質(zhì)粒也很少，譚華榮等[8]從慶大霉素產(chǎn)生菌——棘孢小單孢菌降紅變種AS4890 中分離到一個6.8 kb 的質(zhì)粒pME1，Hasegawa[9]從小單孢菌中分離了2個質(zhì)粒，并用于了小單孢菌質(zhì)粒載體的構(gòu)建，Thomas[10]從小單孢菌中分離到質(zhì)粒pMR2，并進行了全序列的分析.

本實驗所用菌株為小單孢菌40027菌株[11]，可產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素——福堤霉素A.本文以小單孢菌40027菌株內(nèi)源質(zhì)粒為研究對象，對質(zhì)粒的大小、標記及標記后質(zhì)粒的穩(wěn)定性進行了初步研究.

1材料和方法

1.1材料和試劑

菌株和質(zhì)粒：Micromonosporasp. 40027[11]、E.coliDH5α[12]、pOJ260[13]. 大腸桿菌(Escherichiacoli)使用 LB 培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng).小單孢菌40027菌株固體培養(yǎng)基為貝奈特培養(yǎng)基[11]，液體培養(yǎng)基為菌絲體培養(yǎng)基[11]，于30℃培養(yǎng).

Lambda/Hind III、氯霉素、限制性內(nèi)切酶、卡那霉素、T4DNA連接酶(購自大連TaKaRa公司) ，阿泊拉霉素(購自美國Sigma公司) ，DNA Gel Extraction Kit(購自大連TaKaRa公司)，氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等(購自上海國藥集團).

1.2質(zhì)粒DNA的分離和純化

參照文獻[14]分離大腸桿菌質(zhì)粒，參照文獻[15]分離小單孢菌質(zhì)粒.酶切后的DNA使用DNA Gel Extraction Kit 回收純化.

1.3大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化

參照文獻[14] 制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和對質(zhì)粒DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化.

1.4小單孢菌電轉(zhuǎn)化

參照文獻[16]，取小單孢菌新鮮菌絲體或預(yù)萌發(fā)的孢子100 μL、質(zhì)粒約50 ng，加入到預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中，在Bio-Rad電穿孔儀上，設(shè)置電容25 μF，電阻200 Ω，在不同電場強度下電擊，再將轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入30℃溫浴的900 μL菌絲體培養(yǎng)基中.30℃ 250 r/min，培養(yǎng)1 h.將菌液用菌絲體培養(yǎng)基按不同的比例稀釋后取100μL涂布在貝奈特培養(yǎng)基上，24 h后用含阿泊拉霉素15 μg/mL的水溶液覆蓋，30℃培養(yǎng)5～7d.

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒的分離

提取小單孢菌40027 菌株的總DNA，檢測到2個質(zhì)粒(見圖1)，分別命名為pJTU101 和pJTU112.對染色體DNA 與質(zhì)粒pJTU101 DNA 帶進行積分計算，初步確定質(zhì)粒pJTU101 拷貝數(shù)為1～2.

M) λ DNA/Hind III Marker；A) 小單孢菌40027 菌株的總DNA 圖1　小單孢菌40027菌株的總DNA的電泳分析 　　Fig.1　Electrophoresis analysis of total DNA of Micromonospora sp.40027

2.2質(zhì)粒pJTU101的單酶切及其大小的確定

質(zhì)粒pJTU101 經(jīng)BamH I 酶解后，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒至少有5 條BamH I酶切片段(見圖2)，測得該質(zhì)粒的BamH I 酶解片段分別約為：16.0,8.0,5.5,5.5,1.6 kb，質(zhì)粒pJTU101 約為36.6 kb.

M) λ DNA /Hind III Marker； A) 小單孢菌40027 菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101 BamH I 酶切帶譜 圖2　小單孢菌40027 菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101 BamH I 酶切的電泳分析 　Fig.2　Electrophoresis analysis of endogenous plasmid pJTU101 digested by BamH I of Micromonospora sp.40027

2.3內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101抗性基因標記菌株的獲得

質(zhì)粒pJTU101 DNA用BamH I 部分酶切，與pOJ260 經(jīng)BamH I 酶切，并用堿性磷酸化酶(CIAP)處理后的DNA，在T4 DNA 連接酶的作用下連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選阿泊拉霉素抗性大腸桿菌菌株.經(jīng)快檢后，提取其質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamH I 酶切證明：獲得了含有不同pJTU101BamH I 酶切片段插入到pOJ260 的質(zhì)粒.選擇其中一個含有8.0 kb pJTU101BamH I 酶切片段插入到pOJ260 的質(zhì)粒(命名為：pJTU104)用于pJTU101 標記的質(zhì)粒.

將pJTU104與小單孢菌40027菌株進行電轉(zhuǎn)化，篩選得到阿泊拉霉素抗性小單孢菌40027菌株.提取阿泊拉霉素抗性小單孢40027菌株總DNA，以pJTU104 為探針，與阿泊拉霉素抗性小單孢菌40027菌株的總DNA 雜交.雜交結(jié)果(見圖3)顯示：阿泊拉霉素抗性小單孢菌40027菌株與pJTU104 有相一致的兩條陽性信號，其中8.0 kb 的陽性信號與野生型小單孢菌40027 菌株總DNA 經(jīng)BamH I 酶切后的樣品(B)相一致；3.5 kb 的陽性信號與pOJ260 一致，表明質(zhì)粒pJTU104 與小單孢菌40027 菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101 發(fā)生基因重組，小單孢菌40027 菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101被阿泊拉霉素抗性基因標記，該阿泊拉霉素抗性小單孢菌40027菌株命名為LXH1.

I為瓊脂糖凝膠II上的DNA 轉(zhuǎn)移到尼龍膜上 經(jīng)Southern 雜交顯影的照片； A) 阿泊拉霉素抗性小單孢菌40027菌株的 總DNA經(jīng)BamH I 完全酶切片段； B) 野生型小單孢菌40027 菌株總DNA 經(jīng) BamH I 酶切后的樣品；M) λ DNA/Hind III Marker； C) 質(zhì)粒pJTU104 經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I 完全酶切片段 圖3　質(zhì)粒標記菌株的Southern 雜交驗證 Fig.3　Southern confirmation of the strain labeled of plasmid pJTU101

2.4抗性標記質(zhì)粒的穩(wěn)定性檢測

為檢測抗性標記質(zhì)粒在小單孢菌LXH1菌株中的穩(wěn)定性，將含有抗性標記質(zhì)粒的小單孢菌LXH1菌株在未加抗生素的貝奈特培養(yǎng)基上進行4輪的非選擇性培養(yǎng)生長后，挑取出200個單菌落分別轉(zhuǎn)接至含有抗生素和不含抗生素的貝奈特培養(yǎng)基上.在2種平板都能生長的為質(zhì)粒未丟失的菌落；在阿泊拉霉素的平板上不生長，而在不含抗生素的平板上生長的菌落有2種情況：(1) 標記質(zhì)粒丟失，即為質(zhì)粒消除菌株；(2) 標記質(zhì)粒中2個同源的8.0 kb 片段間再次發(fā)生單交換，標記質(zhì)粒恢復(fù)為原始的2個質(zhì)粒，即內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101和質(zhì)粒pOJ260，質(zhì)粒pOJ260 在小單孢菌40027 菌株中不能復(fù)制而丟失，而質(zhì)粒pJTU101 未丟失，該菌株又恢復(fù)到野生型小單孢菌40027 菌株.

通過4輪非選擇性培養(yǎng)，在前3輪非選擇性培養(yǎng)后，未能篩選出阿泊拉霉素抗性消失的菌株；在前4輪非選擇性培養(yǎng)后，挑取的200個菌落中篩選出4株阿泊拉霉素抗性消失的菌株，表示抗性標記質(zhì)粒在小單孢菌40027菌株中較穩(wěn)定.

3結(jié)語

福堤霉素A產(chǎn)生菌——小單孢菌40027菌株含有2個質(zhì)粒pJTU101和pJTU112.本研究通過酶切初步確定了pJTU101的大小為36.6 kb，并通過同

源片段之間發(fā)生單交換實現(xiàn)內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101的抗性標記，驗證表明抗性標記質(zhì)粒在小單孢菌中能穩(wěn)定遺傳.

近年來在小單孢菌中不斷發(fā)現(xiàn)新的抗生素.小單孢菌日益受到了人們的重視和青睞，利用基因工程的手段可使小單孢菌實現(xiàn)高產(chǎn)量、改進質(zhì)量及培育新抗生素產(chǎn)生菌，故發(fā)展和完善小單孢菌基因克隆系統(tǒng)十分必要.建立遺傳操作系統(tǒng)是開發(fā)小單孢菌的重要步驟，而內(nèi)源質(zhì)粒的功能研究是發(fā)展遺傳操作系統(tǒng)的一條捷徑.

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