吳論文，楊美慧，姚瑤，萬曉云，周茂洪

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州，325035)

生物柴油(脂肪酸甲酯)因其環(huán)保性、可再生性、良好的可燃性吸引了人們的目光［1］。傳統(tǒng)的生物柴油原料主是大豆油、菜籽油、棕櫚籽油、向日葵籽油等［2］，但是以植物油脂為原料需要占據(jù)大量土地，這勢必會影響糧食的生產［3］，且用油料植物為原料雖方便但是成本卻很高［4］，所以利用微生物生產油脂逐漸引起了人們的興趣。裂殖壺菌一直以來被認為是理想的DHA生產菌株［5］，其較快的生長速率和較高的油脂含量使其新近又成為生物柴油原料的開發(fā)目標之一。

粗甘油是生物柴油生產過程中的副產物，每生產1 L的生物柴油就會產生80 g的粗甘油［6］。精制后的粗甘油可以應用于化妝品、食品和醫(yī)藥等工業(yè)領域，但精制成本很高，而且生物柴油生產快速發(fā)展所產出的粗甘油遠遠超過精甘油的市場需求，造成精甘油價格急劇下跌，粗甘油則幾乎成了工業(yè)垃圾，若不及時處理，有可能會成為一種新污染源。Meesters等早在1996年就已經發(fā)現(xiàn)粗甘油可以在生物的轉化下生成具有附加價值的產物——油脂［7］。Chi等人也證明以粗甘油為碳源培養(yǎng)Schizochytrium sp.可以得到與以葡萄糖為碳源相似的生長速率和細胞密度［8］。同時以葡萄糖為碳源生產油脂的這種以5 t糖生產1 t油的高成本生產模式，其弊端也日益顯現(xiàn)出來［9］。而國內該方面的研究鮮有報道。

作者曾研究了以生物柴油副產品粗甘油培養(yǎng)裂殖壺菌產油脂的優(yōu)化的培養(yǎng)條件，本文在此基礎上著重研究了粗甘油濃度對裂殖壺菌生長和積累油脂的影響，為進一步的高密度培養(yǎng)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)WZU6961，從采自浙江省溫州市樂清灣西門島南岙山紅樹林的腐敗落葉上分離獲得，保存于-70℃超低溫冰箱內。

1.2 粗甘油

取自溫州中科新能源科技公司，為以餐廚廢油(地溝油)為原料生產的生物柴油副產品。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):甘油30、酵母粉10、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、NaCl 15、(NH4)2SO41、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O 0.003、CoCl2·6H2O 0.000 04、Na2MoO4·2H2O 0.000 04、CuSO4·5H2O 0.002、Ni-SO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01，硫胺素0.010、核黃素 0.020、維生素 B60.060、鈷胺素0.014、硫辛酸0.030、維生素 K 0.020、煙酸0.010、葉酸0.030，pH 6.5～7.0。

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基:同種子培養(yǎng)基。

1.4 生物量的測定

取10 mL發(fā)酵液于干燥稱重后的離心管中，4 000 r/min下離心10 min，用蒸餾水洗滌2～3次后，于90～100℃下烘干至恒重(約24 h)后稱重。

1.5 油脂含量的測定

油脂的提取采用酸熱法［10］。精確稱取0.030 g冷凍干燥菌體在干燥的離心管中，加入4 mol/L的HCl 2 mL振蕩混勻，靜置30 min后置沸水浴煮3 min，速冷至室溫;再加入4 mL氯仿甲醇混合液［V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1］，充分振蕩后于4 000 r/min下離心5 min，取氯仿層;再加入等體積的0.1%NaCl溶液混勻，4 000 r/min下離心5 min，取氯仿層至干燥稱重后的試管中，置于40～50℃真空干燥箱中真空干燥10 h后稱重。

1.6 甘油含量測定

甘油含量采用高碘酸鉀法［11］。取經適當稀釋的樣品10 mL于具塞錐形瓶中，加入25 mL 5.3 g/L的KMnO4溶液，暗處放置30 min，加入200 g/L的KI與2 mol/L HCl各20 mL、蒸餾水15 mL，立即用Na2S2O3標液滴定，近終點時加1 mL淀粉指示液，并將滴定的數(shù)據(jù)用空白(蒸餾水)校正。

甘油含量/(mg·mL-1)=［(V1-V2)×2.302×M/0.1］/V3

其中，V1—空白消耗 Na2S2O3標液體積，mL;V2—樣品消耗 Na2S2O3標液體積，mL;M—Na2S2O3標液濃度，mol/L;V3為樣品體積，mL。

1.7 脂肪酸甲酯化和脂肪酸組成分析

采用三氟化硼乙醚催化法進行脂肪酸甲酯化。在1.5真空干燥得到的油脂中，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL和內標物(花生酸)1 mL(約0.006～0.008 g)，65℃水浴酯化10 min，加2 mL三氟化硼乙醚，煮沸3 min，冷卻后加入1 mL正庚烷，混勻，煮沸1 min，再加入等體積的飽和NaCl溶液，靜置分層后取上層正庚烷相進行氣相色譜-質譜測定。

氣相色譜條件:采用程序升溫法，初始溫度180℃，保持2 min，然后按5℃/min升到240℃，保持16 min;進樣口溫度250℃;FID檢測器，檢測器溫度260℃;進樣量:1 μm。

1.8 甲醇和蛋白質含量測定

甲醇含量按國標(GB 338—2011)測定，蛋白質含量按國標(GB 5009.5—2010)測定。

1.9 礦物質含量測定

采用原子吸收光譜法［12］。

2 結果與討論

2.1 生物柴油副產品粗甘油的預處理和成分分析

將生物柴油副產品粗甘油與水以體積比1∶4混合后，調 pH至6.5～7.0，于8 000 r/min下離心10 min去除脂肪酸鹽(皂)，然后通過培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌去除甲醇(進行粗甘油成分分析時直接將去皂后的粗甘油在121℃下加熱20 min)。

經檢測，預處理后的粗甘油的主要成分見表1。

表1 預處理后粗甘油的主要成分Table 1 The major components of the crude glycerin after the pretreatment

2.2 不同碳源培養(yǎng)裂殖壺菌的比較

分別以純甘油、經預處理后的生物柴油副產品粗甘油和葡萄糖為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌，方法為將保藏菌株(1.5 mL冷凍管融化的菌液)接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25℃、150～160 r/min下活化72 h，然后按體積分數(shù)5%的接種量接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在25℃、150～160 r/min下培養(yǎng)72 h后測定生物量、菌體油脂含量，結果見圖1。

由圖1可知，分別以粗甘油、純甘油和葡萄糖為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌，其生物量分別為(22.20±3.72)、(22.59±2.72)和(22.24±1.86)g/L，菌體油脂含量分別為(71.58±5.57)%、(70.83±2.95)%和(73.10±3.15)%，其生物量和菌體油脂含量沒有顯著的區(qū)別。

圖1 不同碳源下生物量和菌體油脂含量的比較Fig.1 Comparison of biomass and lipid content in different carbon source

2.3 不同粗甘油濃度培養(yǎng)裂殖壺菌的比較

將保藏菌株(1.5 mL冷凍管融化的菌液)接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25℃、150～160 r/min下活化72 h，然后按體積分數(shù)5%的接種量接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在25℃、150～160 r/min下培養(yǎng)48 h得種子，將種子按體積分數(shù)10%接種量接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐內，在25℃下培養(yǎng)，通過控制攪拌速度和通氣量維持整個發(fā)酵過程保持0～30%的氧飽和度，定時取樣測定甘油濃度、生物量和菌體油脂含量，直至甘油耗完或不再消耗為止。發(fā)酵培養(yǎng)基的粗甘油濃度(折算后的實際甘油量)分別為30、60和120 g/L。圖2、圖3和圖4分別為粗甘油濃度為30、60和120 g/L時的發(fā)酵進程曲線。

圖2 30 g/L粗甘油濃度下裂殖壺菌發(fā)酵進程曲線Fig.2 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 30 g/L crude glycerin

從圖2可以看出，當粗甘油濃度為30 g/L時，培養(yǎng)26 h后，生物量和菌體油脂含量趨于平衡，其生物量為(24.38±1.42)g/L，菌體油脂含量為(74.08±2.20)%。從圖3中可看出，當粗甘油濃度為60 g/L時，培養(yǎng)36 h后，菌體油脂和生物量趨于平衡，其生物量為(31.32±1.15)g/L，菌體油脂含量為(76.86±1.68)%。從圖4中可以看出，當甘油濃度為120 g/L時，培養(yǎng)72 h后菌體油脂和生物量趨于平衡，其生物量為(39.89±2.88)g/L，菌體油脂含量為(74.19±1.14)%。

圖3 60 g/L粗甘油濃度下裂殖壺菌發(fā)酵進程曲線Fig.3 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 60 g/L crude glycerin

將不同粗甘油濃度下Schizochytrium sp.WZU6961發(fā)酵參數(shù)進行比較，結果見表2，其中甘油消耗量為3個平行樣的平均值。隨著粗甘油濃度的增加，菌體油脂含量沒有顯著的變化，但粗甘油的生物量和油脂得率系數(shù)以及生物量生產率和油脂生產率逐漸下降，說明粗甘油濃度過高對細胞的生長有抑制效應。從表中看出，粗甘油濃度分別為30 g/L和60 g/L時，生物量生產率分別為0.94 g/(L·h)和0.87 g/(L·h)，油脂生產率分別為0.69 g/(L·h)和0.64 g/(L·h)，兩者比較接近。綜合考慮，粗甘油培養(yǎng)Schizochytrium sp.WZU6961產油脂的最適宜濃度為30 g/L。

表2 不同粗甘油濃度下Schizochytrium sp.6961發(fā)酵參數(shù)的比較Table 2 Comparison of fermentation parameter of Schizochytrium sp.6961 in different crude glycercon centration

CHANG［13］等人研究了裂殖壺菌的生長，將裂殖壺菌的生長分為3個時期即細胞生長期(0～18h)、油脂積累期(18～80 h)、油脂轉化期(大于80 h)，在細胞生長期細胞生長較快，生物量和油脂快速增加;油脂積累期，細胞繁殖停止，生物量增長停止，但是油脂還在積累;油脂轉化期，脂質減少。而本文研究表明(見圖2、圖3和圖4)，細胞生長與油脂積累幾乎是同步的，這與CHANG等人的報道不一致。Shannon［14］等人實驗則發(fā)現(xiàn)，生物量產量和生產率在甘油濃度15～60 g/L時呈上升趨勢，在60 g/L以后，呈下降趨勢;Pyle［5］和 Chi［8］等實驗得出的菌體平均產率分別在粗甘油濃度為40 g/L和64～85 g/L達到最大。而本文的研究結果也與之不同，隨著甘油濃度的提高，生物量產量和生產率逐漸下降，只是粗甘油濃度分別為30 g/L和60 g/L時，生物量生產率和油脂生產率比較接近;這種差異可能是與粗甘油的品質［14］或者培養(yǎng)基的成分或者菌種不同有關。LIANG等的實驗證實最適合細胞生長和達到油脂最大值的的粗甘油濃度為35 g/L，并且他們認為隨著甘油濃度的增加而生物量的減少可能是由于底物抑制或者是甲醇和皂的負作用［15］，這與本文的結果基本一致。

圖4 120 g/L粗甘油濃度下裂殖壺菌發(fā)酵進程曲線Fig.4 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 120 g/L crude glycerin

2.4 不同粗甘油濃度下培養(yǎng)的裂殖壺菌油脂脂肪酸組成比較

將在不同粗甘油濃度下培養(yǎng)的裂殖壺菌發(fā)酵液，在8 000 r/min下離心10 min后得菌體，用去離子水洗滌2次后，進行冷凍干燥，按1.7方法測定油脂的脂肪酸組成，結果如表3所示，表3中數(shù)據(jù)為3個平行樣的平均值。由表3看出，不同粗甘油濃度下培養(yǎng)的裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成沒有顯著的差異。

表3 不同粗甘油濃度下培養(yǎng)的裂殖壺菌油脂脂肪酸組成比較Table 3 Comparison of fatty acid composition of Schizochytrium sp.6961 in different crude glycer concentration

續(xù)表3

3 結論

本文在研究了以生物柴油副產品粗甘油培養(yǎng)裂殖壺菌產油脂的優(yōu)化的培養(yǎng)條件的基礎上，著重研究了粗甘油濃度對裂殖壺菌生長和積累油脂的影響，為進一步的高密度培養(yǎng)研究奠定基礎。結果表明，在溫度、溶氧和培養(yǎng)基其他組分相同的培養(yǎng)條件下，隨著粗甘油濃度的增加，菌體油脂含量和脂肪酸組成沒有顯著的變化;但甘油的生物量和油脂得率系數(shù)以及生物量生產率和油脂生產率逐漸下降，說明甘油濃度過高對細胞的生長有抑制效應;粗甘油濃度分別為30 g/L和60 g/L時，生物量生產率分別為0.94 g/(L·h)和0.87 g/(L·h)，油脂生產率分別為0.69 g/(L·h)和0.64 g/(L·h)，兩者比較接近;綜合考慮得出適宜的粗甘油濃度為30 g/L。甘油濃度為30 g/L時，發(fā)酵時間26 h，生物量、菌體油脂含量和DHA占油脂比例分別為(24.38±1.42)g/L、(74.08±2.20)%和23.72%。

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