黃迪海 秦春芝 盛曉丹張從敬 郭 卉 劉 霞 徐秀榮 秦卓明③*（①山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟(jì)南 250100 ②濟(jì)南市動(dòng)物生物藥品工程技術(shù)研究中心③山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 濟(jì)南）

禽源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)

黃迪海①②秦春芝①②盛曉丹①②張從敬①②郭 卉①②劉 霞①②徐秀榮①②秦卓明①②③*（①山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟(jì)南 250100 ②濟(jì)南市動(dòng)物生物藥品工程技術(shù)研究中心③山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 濟(jì)南）

了解規(guī)?；B(yǎng)禽場(chǎng)的大腸桿菌耐藥情況，為合理選擇抗生素提供參考。對(duì)山東、河北等地2013～2014年送檢病禽進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，對(duì)獲得的大腸桿菌用17種藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明：在分離鑒定的28株大腸桿菌中，有27株對(duì)17種藥物存在不同程度的耐藥性。其中，對(duì)氨芐西林、氯霉素高度耐藥，分別為96.43%和89.29%；對(duì)阿米卡星、多粘菌素和加替沙星耐藥率較低分別為32.14%、35.71%和42.86%，對(duì)舒巴坦鈉與氨芐西林、頭孢曲松、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟的組合物耐藥率最低，為7.14%。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌分離株的耐藥性較為嚴(yán)重，應(yīng)高度重視對(duì)大腸桿菌的耐藥性跟蹤監(jiān)測(cè)并根據(jù)藥敏結(jié)果篩選合適的藥物。

大腸桿菌 分離 鑒定 耐藥性

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的家禽局部或全身性疾病，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一。禽致病性大腸桿菌感染還可以作為禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎等病毒性疫病的繼發(fā)病出現(xiàn)，進(jìn)一步加劇疫病的危害[1]。在家禽養(yǎng)殖過(guò)程中，對(duì)禽大腸桿菌病的防控主要通過(guò)藥物預(yù)防和治療，但由于該菌耐藥性較強(qiáng)、藥敏檢測(cè)結(jié)果滯后、部分養(yǎng)殖場(chǎng)不具備藥敏檢測(cè)條件等原因，敏感藥物的篩選和及時(shí)應(yīng)用具有一定難度。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)2013～2014年間在山東、河北、河南、遼寧等北方地區(qū)分離鑒定的禽大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物，進(jìn)而為大腸桿菌防治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集山東、河北、河南等省送檢的、具有典型心包炎和肝周炎的病雞26批次和病鴨2批次，進(jìn)行大腸桿菌分離和純化，獲得28個(gè)菌株，經(jīng)革蘭氏染色形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)，鑒定為大腸桿菌(見(jiàn)表1)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢驗(yàn)所。

表1 大腸桿菌分離株的來(lái)源 (株)

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，MH肉湯、LB肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等生化培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉為中國(guó)上海試劑總廠產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏片 標(biāo)準(zhǔn)藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；復(fù)方藥敏片為自制，方法是用單方標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，滴加40%舒巴坦水溶液20μl，37℃烘干8h，即每片含舒巴坦8μg；藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn) (μg×片-1)

1.2 方法

1.2.1 生化特性 按常規(guī)方法[2]，將純化的疑似大腸桿菌培養(yǎng)物分別接種至葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖、尿素、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)的生化常規(guī)微量發(fā)酵管中及糖蛋白胨水溶液后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，觀察其變化。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照WHO推薦的Kirby－Bauer法[3]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 生化反應(yīng)

試驗(yàn)表明，28株疑似致病性大腸桿菌均符合大腸桿菌的生化特性，能分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性；在三糖鐵培養(yǎng)基上不產(chǎn)生硫化氫，不水解尿素，在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 28株大腸桿菌對(duì)17種藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果 (株、%)

由表3可見(jiàn)，28株受檢菌中，除1株對(duì)17種藥物均敏感外，27株對(duì)上述藥物均有不同程度的耐藥，其中，對(duì)氨芐西林、氯霉素耐藥率較高，分別為96.43%和89.29%，對(duì)頭孢呋辛、頭孢克洛、依諾沙星耐藥率均為82.14%；對(duì)復(fù)方藥敏片的耐藥率最低，僅為7.14%，較單方平均耐藥率73.57%具有顯著變化；對(duì)阿米卡星、多粘菌素、加替沙星的耐藥率均低于43%。值得關(guān)注的是，山東濰坊市分離株對(duì)加替沙星的耐藥率僅為11.11%(1/9)，而山東高青縣分離株對(duì)阿米卡星的耐藥率達(dá)80%(4/5)；山東高青縣和陽(yáng)谷縣各有1株大腸桿菌對(duì)單方藥敏片全部耐藥，對(duì)復(fù)方藥敏片全部敏感。28株受檢菌中，3株來(lái)自山東濰坊市的大腸桿菌未表現(xiàn)出多重耐藥特點(diǎn)，其余25株均為多重耐藥。由圖1可見(jiàn)，85.7%的菌株對(duì)6種及6種以上藥物耐受，其中，山東分離株占71.4%，其它占14.3%；耐藥類型為7～10重類型的大腸桿菌比例最大，占受檢菌的60.71%。對(duì)被測(cè)藥物耐受種類最多的大腸桿菌有2株，僅對(duì)加替沙星/多粘菌素B、加替沙星/阿米卡星敏感，耐藥類型為15重耐藥，占受檢菌的7.14%，來(lái)自于山東寧陽(yáng)縣和福山區(qū)。

圖1 28株大腸桿菌多重耐藥類型圖

3 討論

（1）本研究分離鑒定的28株大腸桿菌來(lái)源于山東省10個(gè)地市、河北滄州、河南鄭州及遼寧錦州規(guī)?；B(yǎng)禽場(chǎng)，多重耐藥率占89.29%，說(shuō)明上述區(qū)域大腸桿菌耐藥性較強(qiáng)。分離株對(duì)上述養(yǎng)殖場(chǎng)常用藥物氨芐西林耐藥率高，對(duì)較少使用的多粘菌素、阿米卡星、加替沙星耐藥率較低，與當(dāng)前的研究[3,4]一致。分離株對(duì)獸醫(yī)尚未應(yīng)用的頭孢呋辛、頭孢克洛和依諾沙星耐藥率高達(dá)82.14%，可能與大腸桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺類藥物[5]和GyrA基因突變耐喹諾酮藥物[6]的耐藥機(jī)制有關(guān)，提示我們?cè)谟盟庍^(guò)程中要關(guān)注病原菌對(duì)同類抗菌藥物的共同耐藥機(jī)制，合理選擇抗菌藥物。（2）本試驗(yàn)證實(shí)舒巴坦與β-內(nèi)酰胺類藥物合用在體外對(duì)山東等地區(qū)的禽源大腸桿菌具有協(xié)同增效作用，可將大腸桿菌的平均耐藥率由75%降至7%，尤其是對(duì)獸醫(yī)常用藥物氨芐西林效果最為顯著，93%的大腸桿菌對(duì)其藥敏試驗(yàn)結(jié)果由耐藥變?yōu)槊舾?。該作用產(chǎn)生的原因是舒巴坦不可逆的與大腸桿菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶結(jié)合，阻止了該酶對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的水解作用。研究表明舒巴坦在人[7]和動(dòng)物體內(nèi)[8,9]對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物也具有顯著的增效作用，但是舒巴坦口服吸收差，僅適合注射使用。為此，阿根廷的Laboratorios Bago S.A開(kāi)發(fā)上市了口服吸收良好的舒巴坦匹酯；美國(guó)Pfizer和丹麥Leo公司研制出口服藥物舒他西林(舒巴坦與氨芐西林以酯鏈相縮合成雙酯型前體藥物)，1986年在日本上市[10]。在我國(guó)，口服使用的阿莫西林舒巴坦匹酯、舒他西林及阿莫西林克拉維酸復(fù)方制劑已在人醫(yī)領(lǐng)域上市應(yīng)用。在獸醫(yī)領(lǐng)域，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑僅有阿莫西林克拉維酸復(fù)方產(chǎn)品。在畜禽致病菌耐藥性不斷增強(qiáng)的情況下，一方面要規(guī)范使用抗生素，另一方面要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用安全、有效、質(zhì)量可控的復(fù)方抗菌制劑，降低細(xì)菌性傳染病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的危害。

[1] DWARS R M, MATTHIJS M G, DAEMEN A J, et al. Progression of lesions in the respiratory tract of broilers after single infection with Escherichia coli compared to superinfection with E. coli after infection with infectious bronchitis virus[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 127(1- 2): 65- 76.

[2] 韓文瑜. 病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)[M]. 吉林科學(xué)技術(shù)出版社, 1992: 7.

[3] NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY

STANDARDS. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animal approved standard[M]. 2nd ed. Wayne, Pa NCCLS, 2003: M31-A2.

[4] 蓋文燕, 王娟, 曲志娜. 山東地區(qū)大腸桿菌的耐藥性及分子分型研究[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2015, 27(2): 109- 114.

[5] 刁有江, 范學(xué)政. 山東省部分地區(qū)禽源致病性大腸桿菌的血清流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性檢測(cè)[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2014, 48(2): 14- 19.

[6] 張珍珍, 吳俊偉, 楊衛(wèi)軍. 大腸埃希氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2008, 42(7): 36-40.

[7] 張賢春, 陳鼎, 陳海明. 莫西沙星與頭孢哌酮/舒巴坦治療老年患者下呼吸道感染的評(píng)價(jià)[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015(14): 3205- 3207.

[8] 張飛燕. 雞源性大腸桿菌耐藥性檢測(cè)及相關(guān)耐藥基因的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文, 2013:11- 12.

[9] 胡功政, 許蘭菊, 苑麗等. β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦與氨芐西林聯(lián)用的體內(nèi)外抗菌作用研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2002(04): 389- 394.

[10] 王金亮, 王培蘭, 牟小芬等. 阿莫西林/舒巴坦治療感染性疾病的臨床研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015(14): 5373- 5375.

[11] 陳鋆. 舒巴坦匹酯的合成及阿莫西林—舒巴坦匹酯分散片制備工藝研究[D]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文, 2008: 12- 15.

S852..61+2

A

1007-1733(2015)11-0011-03

2015-09-06）

科技部農(nóng)轉(zhuǎn)資金項(xiàng)目(SQ2013ECC600059)；濟(jì)南市科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(201211063)。

*通訊作者