聶雯瑩 羅曉琴 杜美紅 王兆芹* 馮月君 陳煒玲（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司 102206 ②北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心北京市理化分析測(cè)試中心）

牛奶中林可霉素磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立

聶雯瑩①②羅曉琴①②杜美紅③王兆芹①②*馮月君①②陳煒玲①②（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司 102206 ②北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心③北京市理化分析測(cè)試中心）

林可霉素藥物中的醇羥基經(jīng)PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后與氨基丁酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到四碳鏈羧基半抗原產(chǎn)物，即林可霉素半抗原；將辣根過氧化物酶標(biāo)記林可霉素半抗原，制備得到酶標(biāo)抗原；將林可霉素半抗原分別與BSA和OVA偶聯(lián)，制備得到免疫原和包被原，進(jìn)而制備得到林可霉素單克隆抗體，測(cè)得抗體效價(jià)為1:180000；將林可霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到磁標(biāo)抗體；配合全自動(dòng)磁免疫化學(xué)發(fā)光儀建立了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，建立了林可霉素磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得該方法對(duì)牛奶中林可霉素的檢測(cè)限為5.88μg/L，該方法對(duì)林可霉素具有較高的特異性，對(duì)與林可霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似競(jìng)爭(zhēng)的9種藥物均無交叉反應(yīng)。進(jìn)行牛奶空白樣品添加試驗(yàn)時(shí)回收率為85.8%～113.3%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～8.6%，批間變異系數(shù)為8.4%～9.1%。該方法試劑盒配合全自動(dòng)磁免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)乳制品安全監(jiān)管和企業(yè)內(nèi)控工作中推廣應(yīng)用，為我國乳制品監(jiān)管工作提供了技術(shù)支持。

林可霉素 牛奶 磁免疫化學(xué)發(fā)光 試劑盒 全自動(dòng)磁免疫化學(xué)發(fā)光儀

林可霉素(Lincomycin, LIN)又稱潔霉素，是由林肯鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素[1]，具有較強(qiáng)的抑菌活性，主要作用于革蘭氏陽性細(xì)菌[2-3]，林可霉素用作飼料添加劑，有提高增重速率的功效。使用方法主要是添加林可霉素制品混合于飼料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治療奶牛乳房炎，兩種給藥方式都會(huì)造成藥物在牛乳中殘留。我國食品衛(wèi)生法規(guī)定，在應(yīng)用抗生素期間和停藥后5d內(nèi)的乳不能食用，牛奶中的林可霉素殘留，可通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性[4]。農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定了林可霉素在牛奶中的最大殘留限量為150μg/kg。林可霉素殘留量常用的檢測(cè)方法主要有微生物法[5]，高效液相色譜法(HPLC)[6-9]、氣相色譜法(GC)[10-11]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[12-13]、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)[14]、薄層色譜法[15]。本試驗(yàn)建立了一種高效快速檢測(cè)牛奶中林可霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，并配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的全自動(dòng)化，減少人為操作誤差，方法靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度較高，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)過程只需10min，適用于大批量牛奶樣品中林可霉素的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

林可霉素Sigma公司；辣根過氧化物酶Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)和二甲基甲酰胺(DMF)Sigma公司；弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)北京勤邦生物技術(shù)有限公司制備；羧基磁性微珠Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。全自?dòng)磁免疫化學(xué)發(fā)光儀，北京勤邦生物技術(shù)有限公司；FA2104型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；DHP-600型生化培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；Milli-Q Reference純水儀，美國Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 林可霉素半抗原合成 取1.0g林可霉素加入到乙腈中溶解，再加入0.82g重鉻酸吡啶(PDC)，攪拌，加入0.8ml乙酸酐和0.5ml乙酸，室溫?cái)嚢?h，待反應(yīng)完全，停止反應(yīng)并蒸干，上硅膠柱純化，乙酸乙酯：石油醚=1:1洗脫分離，得到產(chǎn)物1。取產(chǎn)物1加甲醇溶解，再加1.2g氨基丁酸水溶液3ml和0.5g氫氧化鉀的水溶液2ml，于60℃加熱反應(yīng)7h，反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，旋蒸，加水，調(diào)節(jié)pH值至6，加乙酸乙酯萃取，蒸干，得到無色油狀物，再加乙醇重結(jié)晶得到林可霉素半抗原產(chǎn)物。合成路線如圖1所示。

圖1 林可霉素半抗原合成路線圖

1.2.2 酶標(biāo)抗原的制備 取10mg林可霉素半抗原，溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg二氯乙烷(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用0.2ml水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取辣根過氧化物酶(HRP)50mg，使之充分溶解在3.8ml磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到HRP溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液于4℃透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到林可霉素酶標(biāo)抗原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫原的制備 將HRP 50mg替換為牛血清白蛋白（BSA）50mg，制備方法同上，得到免疫原。

1.2.4 單克隆抗體的制備 （1）動(dòng)物免疫：用上述制備出的免疫原按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射。第3次免疫后，每次免疫后7d，眼眶上緣采血分離血清，間接ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果決定融合時(shí)機(jī)。細(xì)胞融合前3～5d進(jìn)行沖擊免疫，腹腔注射免疫原100μg/只。（2）細(xì)胞融合：取沖擊免疫后的小鼠的脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后再45s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000）進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5d后用HT培養(yǎng)基半換液，8d后進(jìn)行全換液。（3）雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩采用間接ELISA方法，以包被抗原（預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度）包被酶標(biāo)板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品50μl，再加入細(xì)胞上清液50μl和羊抗鼠IgGHRP 50μl，于37℃反應(yīng)30min，洗板，再加入底物液顯色液100μl，于25℃下避光反應(yīng)15min，再加入終止液50μl，測(cè)定OD450nm值下降到對(duì)照孔的50%以下，判為陽性，經(jīng)2～3次檢測(cè)都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。（4）單克隆抗體制備：將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/只，7～10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 磁標(biāo)抗體的制備 （1）磁珠活化：表面有- COOH基團(tuán)的磁珠(粒徑為2.8μm)，其含量是0.1eq/g，取100μl磁珠，用含有pH5.0、0.05%的吐溫-20的濃度為25mmol/L的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)100ml洗滌兩次，磁分離后移除上清；磁珠活化前，用4℃貯存的上述MES溶液分別配制50mmol/L的EDC和NHS溶液；分別向裝有磁珠的離心管中加入新配置的EDC和NHS溶液各50μl，渦旋混勻，室溫活化30min；將離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離4min，移除上清液，再向其中加入100μl、pH5.0、25mmol/L的MES清洗2～3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。（2）磁珠偶聯(lián)林可霉素單克隆抗體的制備：將10μg林可霉素單克隆溶解到60μl、pH5.0、25mmol/L的MES中，向其中加入3mg活化的磁珠，并用上述濃度MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100μl，輕柔地混勻磁珠與林可霉素單克隆抗體；室溫條件下偶聯(lián)30min或4℃偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離5min，移除上清液；為了淬滅未反應(yīng)的-COOH，可加入100μl、pH7.4的三羥甲基氨基甲烷(TRIS)反應(yīng)15min；用100μl、0.1%BSA、0.1%吐溫-20的鹽酸鹽緩沖液(PBS)清洗封閉好的磁珠3～5次，將磁珠復(fù)溶于含0.1%的BSA、0.05%吐溫-20、0.02%NaN5的磷酸鹽緩沖液中，得到磁標(biāo)抗體，于2～8℃保藏。

1.2.6 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià) （1）將酶標(biāo)抗原稀釋液裝入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；將磁標(biāo)抗體稀釋液裝入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀酶標(biāo)抗原工作液容器中；對(duì)每個(gè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置樣品架上的位置，輸入樣品信息和需要檢測(cè)的測(cè)試項(xiàng)目名稱；將樣品管/標(biāo)準(zhǔn)品管放入已設(shè)定好的樣品架上，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀依次吸取50μl酶標(biāo)抗原、50μl待測(cè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品和50μl磁標(biāo)抗體加入到反應(yīng)杯中，混勻，并在室溫下反應(yīng)15min，再通過清洗裝置進(jìn)行磁分離3min，再用PBS清洗3次，再加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各50μl，檢測(cè)其發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣品中林可霉素的含量與RLU成負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以通過RLU結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算林可霉素的濃度。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液終濃度分別為0、0.3、0.9、1.8、3.6和10.8μg/L，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）檢測(cè)限：對(duì)20份含林可霉素的空白牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為該方法對(duì)實(shí)際樣品的最低檢測(cè)限?；厥章剩喝】瞻着Ｄ虡悠罚謩e向其中添加林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為6、12、24μg/L，每個(gè)濃度作3個(gè)平行，計(jì)算添加回收率和精密度。添加回收率=實(shí)測(cè)值(μg/L)/添加值(μg/L)×100%。（4）特異性：選擇九種結(jié)構(gòu)相似的化合物(克林霉素、北里霉素、螺旋霉素、紅霉素、泰樂菌素、替米考星、安普霉素、泰妙菌素、大觀霉素)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，測(cè)定單克隆抗體的特異性。

2 結(jié)果

2.1 林可霉素半抗原

林可霉素是小分子藥物，沒有免疫原性，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)林可霉素抗原的特異性抗體[16]，本研究林可霉素藥物中的醇羥基經(jīng)PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后與氨基丁酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到四碳鏈羧基半抗原產(chǎn)物。林可霉素半抗原再與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，使得免疫原決定簇充分暴露出來，機(jī)體更容易識(shí)別抗原決定簇，免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體就會(huì)在親和力和特異性上最大程度的與抗原決定簇?cái)M合。林可霉素半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁氫譜測(cè)定，如圖2所示，化學(xué)位移δ=11mg/kg的位置為羧基氫共振吸收峰，化學(xué)位移δ=2.3、1.6、1.3ppm的位置為間隔臂上亞甲基的氫共振吸收峰，證明間隔臂連接成功，林可霉素半抗原合成成功。

圖2 林可霉素半抗原核磁共振氫譜圖

2.2 單克隆抗體效價(jià)

通過效價(jià)測(cè)定，本試驗(yàn)制備的林可霉素單克隆抗抗體的效價(jià)在1:180000。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

建立配套全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀建立牛奶中林可霉素殘留磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 從圖3中可以看出，得到的曲線線性方程為y=-3.1505x-0.3887(線性相關(guān)指數(shù)R2=0.9966)，其中縱坐標(biāo)為RUL/RUL0值，橫坐標(biāo)為林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值。?

圖3 林可霉素磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 檢測(cè)限 根據(jù)對(duì)20份空白牛奶樣品的檢測(cè)結(jié)果，并利用公式計(jì)算檢測(cè)限結(jié)果，見表1，得到試劑盒對(duì)牛奶樣品中林可霉素的最低檢測(cè)限為5.88μg/L。

表1 試劑盒對(duì)牛奶樣品的檢測(cè)限 (μg/L)

2.3.3 試劑盒特異性 選擇與林可霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能10中藥物，用試劑盒測(cè)定交叉反應(yīng)率，結(jié)果如表2所示。

表2 林可霉素單克隆抗體交叉反應(yīng)率 (%)

由表2可知試劑盒的林可霉素單克隆抗體對(duì)林可霉素具有較高的特異性，對(duì)與林可霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物均無交叉反應(yīng)。

2.3.4 準(zhǔn)確度和精密度 通過對(duì)林可霉素添加濃度分別為6、12和24μg/L的樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率得到試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，試劑盒對(duì)牛奶樣品中林可霉素測(cè)定的添加回收率為85.8%～113.3%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～8.6%，批間變異系數(shù)為8.4%～9.1%，批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間變異系數(shù)小于15%。

表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果 (μg/L、%)

3 結(jié)論

林可霉素是小分子藥物，沒有免疫原性，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)林可霉素抗原的特異性抗體，本研究林可霉素藥物中的醇羥基經(jīng)PDC氧化后得到酮基林可霉素，然后與氨基丁酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到四碳鏈羧基半抗原產(chǎn)物，即林可霉素半抗原；將辣根過氧化物酶標(biāo)記林可霉素半抗原，制備得到酶標(biāo)抗原；將林可霉素半抗原分別與BSA和OVA偶聯(lián)，制備得到免疫原和包被原，進(jìn)而制備得到林可霉素單克隆抗體，測(cè)得抗體效價(jià)為1:180000；將林可霉素單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)得到磁標(biāo)抗體；建立了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，建立了林可霉素磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得該方法對(duì)牛奶中林可霉素的檢測(cè)限為5.88μg/L，該方法對(duì)林可霉素具有較高的特異性，對(duì)與林可霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似競(jìng)爭(zhēng)的9種藥物均無交叉反應(yīng)。進(jìn)行牛奶空白樣品添加試驗(yàn)時(shí)回收率為85.8%～113.3%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～8.6%，批間變異系數(shù)為8.4%～9.1%。該方法試劑盒配合全自動(dòng)磁免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適合在我國政府對(duì)乳制品安全監(jiān)管和企業(yè)內(nèi)控工作中推廣應(yīng)用，為我國乳制品監(jiān)管工作提供了技術(shù)支持。

[1] 張小輝, 職愛民, 侯玉澤等. 林可霉素人工抗原的合成與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(8): 1-6.

[2] 謝麟, 謝虹. 抗生素及其動(dòng)物用品種的發(fā)展與應(yīng)用(上)[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2001, 28(5): 31-21.

[3] 王忠, 王立琦. 林可霉素的應(yīng)用[J]. 北方牧業(yè), 2010(6): 28.

[4] Chaleva E, Dzhurov A. Toxicological and pharmacokinetic research on lincomycin hydrochloride in broiler chickens and layer hens[J]. Veterinarno-meditsinski Nauki, 1987, 24(8): 55.

[5] 陳智慧, 古麗曼. 林可霉素在私聊中殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法[J].新疆畜牧業(yè), 2009(4): 47-48.

[6] 陳明, 耿志明. 高效液相色譜法測(cè)定牛奶中林可霉素的殘留量[J].食品科學(xué), 2008, 29(12): 572-574.

[7] 陳麗, 馮建文, 譚寶玲. HPLC法檢測(cè)飼料中林可霉素的含量[J].江西飼料, 2007(2): 26-29.

[8] Moats W A. Determination of lincomycin in milk and tissues by reversed-phase liquid chromatography[J]. J Agric Food Chem, 1991, 39(10): 1812-1816.

[9] 王春艷, 李艷華, 張秀英. 檢測(cè)豬血漿中林可霉素和慶大霉素濃度的HPLC方法的建立[J], 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2011, 42(12):39-44.

[10] 陶燕飛, 于剛, 陳冬梅等. 動(dòng)物可食組織中林可霉素和大觀霉素殘留檢測(cè)方法—?dú)庀嗌V法[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2008, 10(S2): 63-68.

[11] Luo W, Yin B, Ang C Y W, et al. Determination of lincomycin residues in salmon tissues by gas chromatography with nitrogenphosphorus detection[J]. J Chromatography B Biomed Appl, 1996, 687(2): 405-411.

[12] 阮祥春, 曾明華, 趙明. HPLC-ESI-MS/MS 檢測(cè)蜂蜜中林可霉素殘留[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(5):1889-1891.

[13] Benetti C, Piro R, Binato G, et al. Simultaneous determination of lincomycin and five macrolide antibiotic residues in honey by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry(LC -MS /MS)[J]. Food Additives and Contaminants, 2006, 23(11): 1099-1108.

[14] Sin D W, Wong Y, Ip A C. Quantitative analysis of lincomycin in animal tissues and bovine milk by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 34(3):651-659.

[15] 王鑫芳, 劉穎, 李明江等. 用薄層色譜法檢測(cè)林可霉素B組分[J].中國生化物藥雜志. 2006, 27(6): 371-382.

[16] Fasciglione F.G., Marini S., Bannister J.V.et al. Hapten-carrier interactiona and their role in the production of monoclonal antibodies and their role in the production of monoclonal antibodies against hydrophobie haptens. Hybridoma, 1996, 15:1-9.

S859.79+6

A

1007-1733(2015)11-0006-04

2015-03-31）

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2013YQ14037105)

*通訊作者