何澤瑜，韓立榮，劉雪茹，馮俊濤，張　興

(西北農(nóng)林科技大學 無公害農(nóng)藥研究服務中心,陜西省生物農(nóng)藥工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

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天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備

何澤瑜，韓立榮，劉雪茹，馮俊濤，張興

(西北農(nóng)林科技大學 無公害農(nóng)藥研究服務中心,陜西省生物農(nóng)藥工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 合成并鑒定天名精內(nèi)酯酮人工抗原，制備天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體，為天名精內(nèi)酯酮作用靶標的免疫化學定位奠定基礎?！痉椒ā?通過天名精內(nèi)酯酮4位羰基和鹽酸氨基脲氨基的親核加成反應制備半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)，使用MS和NMR對其結(jié)構進行鑒定；采用戊二醛法將半抗原和載體蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，合成天名精內(nèi)酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA)，采用紫外吸收掃描法、紅外光譜法對免疫原及包被原進行鑒定；用制備好的免疫原免疫健康BALB/c小鼠獲得天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體，通過間接非競爭ELISA法測定其效價?！窘Y(jié)果】 成功制備了天名精內(nèi)酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA)，獲得了效價為128 000的天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體。【結(jié)論】 成功制備了天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體。

[關鍵詞]天名精內(nèi)酯酮；半抗原；人工抗原；酶聯(lián)免疫吸附分析

天名精內(nèi)酯酮是卡拉布烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物，最早于1964年從天名精屬植物天名精(Carpesiumabrotanoides)的果實中分離得到[1]，并表現(xiàn)出較好的醫(yī)用生物活性[2-4]。西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心前期對天名精內(nèi)酯酮農(nóng)用生物活性的研究工作表明，天名精內(nèi)酯酮是一種優(yōu)秀的廣譜抑菌活性物質(zhì)，對小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeonian)和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)等12種病原菌均具有較好的抑制活性[5]；以其為先導，通過結(jié)構改造，衍生合成出酯類[6]、肟酯[7]和腙類[8]等一系列化合物，這些化合物中大部分均表現(xiàn)出較強的抑菌活性；對作用機理的初步探索發(fā)現(xiàn)，天名精內(nèi)酯酮可抑制病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈復合酶的活性，從而影響病原菌的生物氧化過程[9]，但其具體的作用靶標仍不明確，這嚴重阻礙了天名精內(nèi)酯酮的開發(fā)利用。

免疫分析作為作用機理研究的重要手段之一，已成功應用于蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)伴胞晶體蛋白作用靶標的定位[10-12]。同時，農(nóng)藥免疫分析還應用于一些除草劑和殺菌劑作用機理的研究，如Young等[13]利用免疫熒光顯微技術確定了苯酰菌胺對辣椒疫霉菌微管骨架的破壞作用，Tresch等[14]利用免疫化學定位技術證明高效麥草氟甲酯對微管組裝具有抑制作用。本研究以天名精內(nèi)酯酮為原料合成天名精內(nèi)酯酮人工抗原，通過免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體，旨在為天名精內(nèi)酯酮作用機理的研究提供技術手段。

1材料與方法

1.1材料

儀器：核磁共振譜儀(Bruker Avance 500 MHz)、紅外光譜儀(Nicolet Avatar 330FT-IR)、紫外可見分光光度計(HITACHI U3310)、酶標儀(TECAN Sunrise)、高速冷凍離心機(MIKRO22R)、凍干機、超純水凈化儀(D8611 Branstead)、洗板機(Thermo WELLWASH PLUS)、液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher)。

試劑：天名精內(nèi)酯酮(由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心提供)、牛血清蛋白(BSA，Sigma)、卵清蛋白(OVA，Sigma)、弗氏完全佐劑(FCA，Sigma)、弗氏不完全佐劑(FICA，Sigma)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma分裝進口)、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(HRP-IgG，北京康維)、鹽酸氨基脲、無水乙酸鈉、無水乙醇、戊二醛、N、N-二甲基亞砜均為分析純。試驗動物為6周齡的BALB/c小鼠(購于西安交通大學實驗動物中心)。

1.2方法

1.2.1天名精內(nèi)酯酮半抗原的合成參照李江華[15]的方法并做適當?shù)母膭樱唧w合成路線見圖1。

圖 1　天名精內(nèi)酯酮半抗原的合成路線

向1.2 mmol鹽酸氨基脲水溶液中加入1.4 mmol乙酸鈉，在攪拌條件下，向混合物中加入含有1 mmol天名精內(nèi)酯酮的甲醇溶液，60 ℃下水浴反應。出現(xiàn)大量白色沉淀后(約4 h)終止反應。靜置冷卻，抽濾。用甲醇和水混合溶劑重結(jié)晶，得白色固體物質(zhì)，并用NMR和MS進行結(jié)構鑒定。

1.2.2天名精內(nèi)酯酮人工抗原的合成和鑒定采用戊二醛法將帶有游離氨基的天名精內(nèi)酯酮半抗原和載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)[16-17]，制備天名精內(nèi)酯酮人工抗原，具體如圖2所示。

將20 mg牛血清蛋白溶于2 mL pH=7.4的PBS(磷酸鹽緩沖溶液)中，緩慢滴加10 mg半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)溶液和90 μL 25%戊二醛溶液。室溫下攪拌反應4 h后，取出反應物，用PB(磷酸緩沖溶液)于4 ℃下透析3 d。透析完畢后，冷凍干燥，-20 ℃保存，即得免疫原CN-BSA。用同樣的方法制備包被原CN-OVA。

使用紅外光譜法[18]和紫外吸收掃描法[19]鑒定人工抗原。

圖 2　天名精內(nèi)酯酮人工抗原的合成路線

1.2.3天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備參照張靜[20]的方法免疫BALB/c小鼠。用生理鹽水稀釋免疫原至400 μg/mL，用等體積的弗氏完全佐劑(CFA，首次免疫時使用)或弗氏不完全佐劑(FICA，加強免疫時使用)，采用渦旋振蕩法乳化制備免疫原乳劑。選取3只健康的6周齡BALB/c小鼠，用制備好的免疫原乳劑按照表1的方法免疫小鼠。取血前3 d，沖擊免疫。摘除眼球取血，并用硫酸銨/辛酸沉淀法[17]純化抗血清，向抗血清中加入終濃度為0.01%的疊氮鈉，分裝， -20 ℃保存。

表 1　小鼠免疫方案

注：“-”表示未加佐劑或未注射免疫原。

Note:“-” means no adjuvant or no immunization.

1.2.4抗血清效價的測定使用間接非競爭ELISA法測定抗血清效價[21]。用質(zhì)量濃度為5 μg/mL的包被原包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃過夜，用PBST(含0.05% Tween-20 PBS溶液)洗板3次；加入質(zhì)量分數(shù)1% OVA溶液封閉1 h，200 μL/孔，再次洗板；以4 000倍為起點，倍比稀釋抗血清，加入相應酶標板孔內(nèi)，100 μL/孔，每個質(zhì)量濃度2個平行孔，并設置空白孔和陰性對照孔，37 ℃孵育1 h，洗板；加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(1∶3 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板；加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺，tetramethylbenzidine)底物溶液顯色10 min，100 μL/孔；加入2 mol/L的H2SO4終止反應，50 μL/孔。于450 nm下用酶標儀測定OD值。以待測孔OD值(P)/陰性對照孔OD值(N)≥ 2.1(即P/N≥ 2.1)的最大稀釋倍數(shù)作為抗血清的最終效價。

2結(jié)果與分析

2.1天名精內(nèi)酯酮半抗原結(jié)構的鑒定

通過MS和NMR對天名精內(nèi)酯酮半抗原，即天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)的結(jié)構進行鑒定，結(jié)果如下。

1H-NMR (500 MHz，CD3Cl) δ:6.27 (1H,d,J=2.6 Hz,H-13),5.59 (1H,d,J=2.4 Hz,H-13),4.79～4.84 (1H,m,H-8),3.16～3.22(1H,m,H-7),2.32～2.37(2H,m,H-3),2.25～2.28(2H,m,H-2),1.86(3H,s,H-15),1.48～1.55(2H,m,H-9),1.12(3H,s,H-14),0.91～0.98(2H,m,H-6),0.47～0.52(1H,m,H-5),0.37～0.41(1H,m,H-1)。

13C-NMR(125 MHz，CD3Cl)δ：170.45(C-12),157.85(C-4),149.97(C-16),139.03(C-11),122.61(C-13),75.59(C-8),38.76(C-3),37.68(C-7),37.31(C-9),34.40(C-1),30.75(C-6),25.93(C-2),23.02(C-5),18.38(C-15),17.14(C-10),15.41(C-14)。

ESI-MS:m/z：306.15 C16H23O3N3([M+H]+)。

2.2天名精內(nèi)酯酮人工抗原的鑒定

采用紫外吸收掃描法和紅外光譜法對半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物進行鑒定，結(jié)果如圖3～6所示。由圖3和4可知，載體蛋白BSA和OVA的最大紫外吸收波長出現(xiàn)在278 nm處，半抗原在235～295 nm未發(fā)現(xiàn)明顯的特征吸收峰，而經(jīng)戊二醛法偶聯(lián)合成的人工抗原CN-BSA和CN-OVA的最大吸收波長分別出現(xiàn)在269 nm和267 nm處。2種人工抗原CN-BSA和CN-OVA的紫外吸收光譜是半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲與載體蛋白吸收光譜的整合，表明半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功。

國家體育場（鳥巢）是第29屆夏季奧運會的主體育場。奧運會后，國家體育場公司按照“政府主導、社會參與、企業(yè)運作”的要求，充分利用奧運場館遺產(chǎn)，打造鳥巢旅游新亮點，引進頂級賽事演出活動，創(chuàng)辦青少年公益賽事，培育鳥巢自主品牌項目，打造全新的商業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈，探索場館多元化經(jīng)營，實現(xiàn)了鳥巢賽后的可持續(xù)發(fā)展，獲得了社會各界的廣泛贊譽

由圖5可以看出，CN-BSA的紅外圖譜中包含了載體蛋白BSA的特征吸收譜帶，如1 655 cm-1處的BSA酰胺譜帶Ⅰ和1 543 cm-1處的酰胺譜帶Ⅱ，以及2 929 cm-1處較弱的-CH2-吸收。同時在CN-BSA的紅外光譜中還存在半抗原CN和BSA偶聯(lián)后的1 439 cm-1處的-CH2-的δCH吸收，以及1 720 cm-1處的半抗原分子的羰基吸收，由此可判斷免疫原CN-BSA合成成功。由圖6可以看出，包被原CN-OVA的紅外圖譜中包含了載體蛋白OVA的特征吸收譜帶，如1 653 cm-1處的酰胺譜帶Ⅰ和1 539 cm-1處的酰胺譜帶Ⅱ，以及偶聯(lián)后的1 439 cm-1處-CH2-的δCH吸收，1 724 cm-1處的半抗原分子的羰基吸收，由此表明包被原CN-OVA合成成功。

結(jié)合上述2種鑒定方法，可以確定半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功，合成出了免疫原CN-BSA和包被原CN-OVA。

圖 3　半抗原CN、免疫原CN-BSA和載體蛋白BSA的紫外光譜掃描圖

圖 5　載體蛋白BSA與免疫原CN-BSA的紅外光譜掃描圖

2.3抗血清效價的測定

使用免疫原CN-BSA沖擊免疫BALB/c小鼠后3 d，摘除眼球取血，純化后獲得抗血清，進行適當稀釋后用酶標儀測定其在450 nm波長處的OD值，確定抗血清效價，結(jié)果如表2所示。由表2可知，經(jīng)免疫原CN-BSA免疫后的BALB/c小鼠對半抗原CN產(chǎn)生了較好的免疫應答，而當抗血清稀釋至 128 000 倍時，P/N值為 2.729>2.1，即獲得的抗血清效價為128 000。較高效價抗血清的獲得表明人工抗原的成功合成和多克隆抗體的成功制備。

圖 6　載體蛋白OVA與包被原CN-OVA的紅外光譜掃描圖

血清稀釋倍數(shù)DilutionsofantiserumOD值ODvalue待測血清Testedantiserum陰性對照NegativeantiserumP/N40001.5440.2985.18180001.2170.2624.645160000.9440.2344.034320000.7170.2123.382640000.6320.1913.3081280000.4530.1592.7292560000.3010.1581.9055120000.2230.1581.141

3討論

3.1半抗原和載體蛋白偶聯(lián)位點的選擇

通常小分子半抗原不具有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)形成人工抗原，借助載體蛋白的T細胞表位間接誘導B細胞激活、分化增殖，產(chǎn)生針對半抗原分子的特異性抗體[22]。研究表明，相同的半抗原分子，不同的偶聯(lián)位點所形成的人工抗原的空間結(jié)構不同，即與載體結(jié)合后產(chǎn)生的人工抗原表面所暴露出的抗原決定簇不同，導致產(chǎn)生的抗體在效價、親和力和特異性上均存在差異[23]。根據(jù)免疫系統(tǒng)通常對載體遠端結(jié)構識別能力最強，而對連接位點部分特異性較弱的原則[24]，要制備高效價和高特異性的抗體，半抗原分子中的偶聯(lián)位點應遠離半抗原分子的特征結(jié)構和官能團(如苯環(huán)或雜環(huán)等)，使半抗原分子特征結(jié)構部分得以充分暴露，易于被動物免疫系統(tǒng)識別，同時還可避免載體蛋白對半抗原分子特征結(jié)構的屏蔽作用。在選擇偶聯(lián)位點時還應避免對半抗原分子的電子分布的影響[23]。本試驗以半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲16位C作為偶聯(lián)位點，該偶聯(lián)位點的選擇遠離了天名精內(nèi)酯酮特征結(jié)構α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯環(huán)結(jié)構，對天名精內(nèi)酯酮的電子分布影響較小，易于免疫系統(tǒng)對該特征結(jié)構的識別，從而產(chǎn)生高效價和高特異性的抗體，效價128 000抗血清的獲得，證明了該設計思路的合理性。

3.2免疫分析是鑒定人工抗原的必需步驟

人工抗原的制備是為了能夠引起動物的免疫反應，從而獲得能識別半抗原分子的高特異性和高效價的抗體，因而人工抗原是否合格的評判標準應該為是否有特異性抗體產(chǎn)生。然而，通常采用的人工抗原的鑒定方法有SDS-PAGE法、紅外光譜法、紫外吸收掃描法、同位素標記法等[25]，但這些方法均僅能證明半抗原和載體蛋白是否成功偶聯(lián)，并不能最終確定所制備的人工抗原是否能夠引起動物的免疫反應從而獲得滿足要求的抗體。故除了要使用上述檢測方法確定偶聯(lián)是否成功外，還必須進一步使用免疫檢測法對人工抗原的質(zhì)量進行評價。本試驗采用紅外光譜法和紫外吸收掃描法2種方法對免疫原和包被原進行鑒定，證明半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功，并使用間接非競爭ELISA法測定了抗血清的效價，高效價抗血清的獲得證明了人工抗原的成功制備。

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Preparation of polyclonal-antibody against carabrone

HE Ze-yu,HAN Li-rong,LIU Xue-ru,FENG Jun-tao,ZHANG Xing

(ResearchandDevelopmentCenterofBiorationalPesticide,TechnologyandEngineeringCenterofBiopesticide,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study synthesized and identified artificial antigen of carabrone,and prepared polyclonal-antibody. 【Method】 Reaction of carabrone and semicarbazide hydrochloride was conducted to obtain hapten carabrone semicarbazone,which was characterized by MS and NMR spectrum.Then,the haptens were conjugated to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) for generation of immunogen (CN-BSA) and coating antigen (CN-OVA),respectively.The structures of immunogen and coating antigen were identified by UV and IR spectrum.BALB/c mice were immunized with CN-BSA and polyclonal antisera were produced.The titer of antiserum was also detected by indirect non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay.【Result】 Hapten was synthesized,and immunogen (CN-BSA) and coating antigen (CN-OVA) were obtained successfully.Polyclonal-antibody against carabrone was prepared and the titer of antiserum was 128 000.【Conclusion】 The artificial antigen and polyclonal-antibody against carabrone was prepared successfully.

Key words:carabrone;hapten;artificial antigen;ELISA

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.018

[收稿日期]2014-07-16

[基金項目]國家自然科學基金項目(31272074)；陜西省自然科學研究計劃項目(2012JQ3004)；中央高校基本科研業(yè)務費專項(ZD2012004)

[作者簡介]何澤瑜(1990-)，男，云南勐臘人，在讀碩士，主要從事農(nóng)藥毒理學研究。E-mail:skyhugh2012@gmail.com[通信作者]馮俊濤(1967-)，男，河南登封人，教授，博士，主要從事生物農(nóng)藥及植物保護研究。E-mail:jtfeng@126.com

[中圖分類號]R392.11

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0129-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.036.html