郝瑞芳 景 浩

（山西林業(yè)職業(yè)技術學院園藝系1，太原 030009）（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院2，北京 100083）

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郝瑞芳1景 浩2

（山西林業(yè)職業(yè)技術學院園藝系1，太原 030009）（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院2，北京 100083）

運用天冬酰胺/葡萄糖模式反應體系研究了牛磺酸對富含淀粉的食品中丙烯酰胺生成的影響及其抑制機理。試驗結果顯示：牛磺酸能夠顯著抑制天冬酰胺/葡萄糖反應體系中丙烯酰胺的生成，且抑制率與濃度呈劑量關系。運用LC－QTOF分析得到2種主要的反應產(chǎn)物：丙烯酰胺－?；撬峒雍衔锖捅０范垠w－?；撬峒雍衔?。此外，?；撬崤c葡萄糖共存于同一體系中加熱時，葡萄糖的含量顯著下降，說明牛磺酸可與葡萄糖發(fā)生反應。通過模式反應體系證明：牛磺酸能夠顯著降低富含淀粉食品中的丙烯酰胺含量；抑制機理主要是?；撬崤c丙烯酰胺直接發(fā)生反應，反應產(chǎn)物為丙烯酰胺－?；撬峒雍衔锖捅０范垠w－?；撬峒雍衔?，從而除去體系中已經(jīng)生成的丙烯酰胺。此外，?；撬崮軌蚺c葡萄糖發(fā)生美拉德反應，從而與天冬酰胺競爭消耗體系中的葡萄糖，減少了食品中的丙烯酰胺含量。

牛磺酸 富含淀粉食品 丙烯酰胺 抑制機理

2002年瑞典國家食品局和斯德哥爾摩大學的研究結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長時間油炸的食品（如炸薯條和谷物）中含有一定量的丙烯酰胺（Acrylamide，AA）。AA是一種具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性的物質(zhì)，已被國際癌癥研究總署列為“人類可能的致癌物”（2A類）［1］。AA的形成主要是食品中的氨基酸（主要是天冬酰胺，Asparagine，Asn）和還原糖（如葡萄糖，Glucose，Glc；果糖，F(xiàn)ructose，F(xiàn)ru）在 120℃以上的高溫油炸或焙烤條件下，通過美拉德反應而生成，且隨著加熱溫度的升高，AA的生成明顯增加［2－3］。多數(shù)食品因含一定量的氨基酸、蛋白質(zhì)和糖，在加熱過程發(fā)生美拉德反應。

研究表明在模擬體系和谷物、馬鈴薯等食品體系中添加甘氨酸、賴氨酸和半胱氨酸能夠有效地抑制 AA的生成［4－6］。牛磺酸（Taurine，Tau）是一種含硫氨基酸，是動物機體內(nèi)含量最豐富的自由氨基酸，廣泛存在于所有動物的組織、細胞內(nèi)，特別是神經(jīng)、肌肉和腺體中的含量較高，以海洋生物中含量為最高［7］。?；撬崮軌騾⑴c美拉德反應，有研究表明?；撬崮芡ㄟ^競爭性消耗葡萄糖來抑制白蛋白的糖基化反應。

本試驗以天冬酰胺/葡萄糖（Asn/Glc）體系為模型，利用高效液相色譜法研究?；撬釋κ称敷w系中AA的生成是否有抑制作用，進一步利用液相－飛行時間質(zhì)譜法證實了其抑制機理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SPD－20A型高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司，配紫外檢測器；Thermo Hypersil ODSC18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）：美國 Thermo公司；Agilent 1200型液相色譜儀：美國 Agilent公司；Qstar Elite四極桿飛行時間質(zhì)譜儀：美國Applied Biosystems公司；Sunfire C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：美國Waters公司。

丙烯酰胺標準品，純度99.5%：德國 Labor Dr.Ehrenstorfer－Schafers公司；牛磺酸：國藥集團化學試劑有限公司。

丙烯酰胺儲備液濃度1.0 mg/g；磷酸鹽緩沖液配制：稱取 KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加 900 mL去離子水溶解，用18%的HCl調(diào)pH值至7.4，最后定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 模式反應體系的確立

1.2.1.1 Asn/Glc/Tau反應體系

準確稱取 Asn 0.15 g，Glc 0.20 g，稱取4份，1份做為對照組，其余3份中分別加入100 mg/g的Tau 100、500、1 000μL，分別置于 4個 10 mL的容量瓶中，用PBS（pH 7.4）溶解，調(diào)溶液pH為8.0，定容至10 mL，使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L，Tau的終濃度分別為1、5、10 mg/g。

1.2.1.2 Tau/Glc反應體系

準確稱取 Tau 0.10 g，Glc 0.20 g，置于10 mL的容量瓶中，用PBS（pH 7.4）溶解，調(diào)溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，終濃度分別為 Tau 10 mg/g，Glc 0.1 mol/L。

1.2.1.3 AA/Tau反應體系

準確稱取AA 1.0 mg，Tau 0.10 g，置于10 mL的容量瓶中，用PBS（pH 7.4）溶解，調(diào)溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，終濃度分別為 AA 100μg/g，Tau 10 mg/g。

將配好的上述反應體系分別加入耐高壓玻璃管中，將耐高壓玻璃管密閉并置于油浴鍋中，分別于150℃下加熱0～60 min，反應體系的溫度用紅外測溫儀測量。反應結束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應。

1.2.2 HPLC－UV分析條件

采用高效液相色譜－紫外檢測法（HPLC－UV）測定反應體系中的AA含量，操作條件為：色譜柱Thermo Hypersil ODS C18（250 mm × 4.6 mm，5μm），保護柱 C18（13 mm ×4.0 mm，5μm），流動相甲醇∶水 ＝3∶97，等濃度洗脫，流速 0.7 mL/min，柱溫為室溫（25℃），進樣量20μL，紫外檢測器，波長204 nm。

AA標準曲線的制定：用超純水稀釋AA標準品儲備液，分別配制成 1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/g的AA標準溶液，按上述條件進行分析。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制AA標準曲線。

1.2.3 LC－QTOF分析條件

對AA/Tau反應體系中的產(chǎn)物采用液相－飛行時間質(zhì)譜（Liquid Chromatography-QSTAR Time of Flight，LC－QTOF）得到的離子碎片進一步確定［8］。液相條件為：Agilent 1200型液相色譜儀，Sunfire C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5μm），柱溫為室溫，流動相甲醇∶水 （0.1%甲酸）＝10∶90，流速 0.3 mL/min。Turbo電噴霧離子源，正離子模式，掃描的質(zhì)荷比范圍為50～600。質(zhì)譜參數(shù)：離子源電壓4 200 V，霧化氣（Gas 1）50 V；輔助氣 （Gas 2）60 V；簾氣 （CUR）20 V；脫溶劑氣溫度 450℃；解簇電壓（DP）50 V；聚焦電壓（FP）380 V。監(jiān)測離子：AA－Tau加合物m/z197，m/z268。AA聚合物m/z143，m/z214。待測反應產(chǎn)物用含0.1%甲酸水溶液稀釋10倍，過0.45 μm濾膜，進行分析。

1.2.4 統(tǒng)計分析

每個試驗重復3次，每個重復測定3次，結果表示為Means±SD。采用 MINITAB 13.20軟件進行One－way ANOVA分析。鄧肯氏多重檢驗用來確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 反應體系中AA含量測定條件的篩選

2.1.1 檢測波長的選擇

首先取1.0μg/g的AA標準溶液，用紫外分光光度計在190～300 nm波長范圍內(nèi)掃描，見圖1，結果顯示AA在204 nm處有最大吸收，因此選擇檢測波長為204 nm測定反應體系中的AA含量，這與文獻報道的研究結果基本一致［9－10］。

圖1 丙烯酰胺標準溶液的紫外光譜掃描圖

2.1.2 流動相的選擇

采用甲醇和水的混合溶劑作為流動相，篩選不同濃度甲醇和水的配比，將甲醇和水的比例從0∶100、1∶99、2∶98……，一直調(diào)到 10∶90，用 HPLCUV檢測AA的分離效果和峰形。結果顯示：當甲醇和水的比例為3∶97時，AA與反應體系中的其他成分可以達到很好的分離，AA出峰時間為6.944 min，這與文獻報道的結果一致［9］。

2.1.3 Asn/Glc反應體系中AA含量的測定

用HPLC－UV法測定 Asn/Glc反應體系中的AA含量。以不同濃度的AA標準品溶液進樣，每個濃度測定3次，取平均值，以AA濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，線性方程為A＝278 512C－15 148，R2＝0.998（n＝3）表明 AA在0～20μg/g范圍內(nèi)線性關系良好。

為了更好地看出AA標準品和Asn/Glc反應體系中AA的出峰時間、峰形及各反應時間下的AA含量，選擇橫、縱坐標均相同的幾個加熱溫度和時間下的AA圖譜進行比較（見圖2）。結果顯示：不同加熱溫度和加熱時間下得到的Asn/Glc反應體系中的AA也能夠在該色譜條件下進行很好的分離，且反應產(chǎn)物稀釋10倍后，產(chǎn)物中的AA濃度恰好在AA標準曲線的線性范圍內(nèi)，因此選擇稀釋倍數(shù)為10倍。

圖2 丙烯酰胺標準品和天冬酰胺/葡萄糖反應體系中生成的丙烯酰胺的色譜圖

2.2 Tau對Asn/Glc反應體系中AA生成的影響

圖3顯示了Tau對Asn/Glc反應體系中AA生成的影響。當添加1、5、10 mg/g的 Tau時，體系中AA的生成量分別從117.7μg/g（對照組）降低至97.9、78.4、43.1μg/g，對 AA生成的抑制率分別達到16.8%、33.4%、63.4%。說明高、中、低濃度的Tau均能顯著抑制Asn/Glc體系中AA的生成。該結果與甘氨酸的的抑制率接近［11］，在 Asn/Glc模式反應體系中添加10 mg/g的甘氨酸，能使體系中AA的含量降低約60%。Shin等［12］研究表明在Asn/Glc水溶液體系中添加0.1%～2.5%的Tau，于150℃加熱30 min，Tau顯著抑制了體系中AA的生成；土豆片在油炸前預先用0.1%～2.0%的Tau浸泡30 min，結果顯示油炸后土豆片中的AA含量顯著下降。

圖3 ?；撬釋μ於０?葡萄糖反應體系中丙烯酰胺生成的影響

2.3 Tau抑制AA的機理研究

2.3.1 LC－QTOF分析

利用LC－QTOF MS分析能夠進一步確定AA/Tau反應體系中的產(chǎn)物，且四極桿飛行時間質(zhì)量分析器能夠給出物質(zhì)的精確分子質(zhì)量。圖4給出了AA/Tau體系于150℃反應60 min時體系中各物質(zhì)的色譜圖。反應60 min時，體系中除包含有未反應完的AA和Tau外，新生成的物質(zhì)有AA－Tau加合物、AA二聚體－Tau加合物、AA二聚體和AA三聚體。m/z197的 ［M＋H］＋是一分子AA（Mr＝71）和一分子Tau（Mr＝125）形成的 AA－Tau加合物，m/z268的［M＋H］＋是兩分子 AA（Mr＝71）和一分子 Tau（Mr＝125）形成的AA二聚體－Tau加合物，AA－Tau加合物的含量遠遠高于AA二聚體－Tau加合物。Tau含有NH2基團，與AA的CH2＝CH2不飽和雙鍵易發(fā)生麥克爾加成反應，生成的AA－Tau加合物還含有1個親核基團（NH），可以和另一分子的AA結合形成AA二聚體－Tau加合物，該結合方式與甘氨酸和AA的結合方式類似［11，13］。m/z143的［M＋H］＋是兩分子 AA（Mr＝71）聚合形成的 AA二聚體，m/z214的 ［M＋H］＋是三分子 AA（Mr＝71）的聚合產(chǎn)物，AA二聚體的含量高于三聚體。Stadler等［14］研究表明AA含有不飽和雙鍵，在高溫下很容易發(fā)生聚合反應，且反應體系中有鹽的存在更容易促進AA的聚合［15］。LC－QTOF結果表明AA－Tau加合物是生成的主要產(chǎn)物，證實了Tau能夠與AA直接發(fā)生反應，從而消除體系中的AA。

圖4 加熱60 min后丙烯酰胺/牛磺酸體系中生成物的色譜圖

2.3.2 反應體系中Glc含量的變化

Glc在單獨加熱和Tau/Glc反應體系中的含量變化如表1所示，Glc單獨加熱時，反應15 min，Glc含量下降了11%，再延長反應時間，Glc含量無明顯變化，可能是由于Glc在高溫下加熱時自身發(fā)生降解而使?jié)舛嚷杂邢陆担摻Y果與文獻報道的一致［10］。當Glc與Tau共存于同一體系中加熱時，Glc含量顯著下降，說明Tau與Glc發(fā)生反應，導致Glc含量下降。早有研究報道Tau和乳糖之間可以發(fā)生美拉德反應，生成褐色的產(chǎn)物［16］。而且當把Tau加入到葡萄糖/白蛋白體系中時，Tau能通過競爭性消耗葡萄糖來抑制白蛋白的糖基化反應［17］。

表1 各反應體系加熱（150℃）不同時間下的葡萄糖含量的變化

2.3.3 反應體系中Tau含量的變化

如圖5所示，Tau單獨加熱時含量無變化，說明Tau的熱穩(wěn)定性很好，該結果與文獻［18］一致。但當Tau與Glc于同一體系中加熱時，Tau的含量顯著下降，且隨著反應時間的延長而顯著降低，反應達到60 min時Tau含量降低最大，達到28%，進一步證明了Tau與Glc一起加熱時會發(fā)生反應。有研究結果表明將Tau與乳酸置于同一緩沖液中加熱，Tau的含量下降，體系的褐變程度增加，說明Tau能夠與乳酸發(fā)生美拉德反應［16］。將Tau添加到葡萄糖－白蛋白的混合溶液中于37℃孵育30 d，Tau能夠與白蛋白競爭消耗葡萄糖，從而抑制白蛋白的糖基化反應［17］。

圖5 各反應體系加熱（150℃）不同時間下的?；撬岷康淖兓?/p>

2.3.4 Tau抑制AA的反應機理的提出

根據(jù)上述研究結果，本試驗提出2條Tau抑制Asn/Glc反應體系中AA的反應途徑（圖6）。一條是Tau通過與Asn競爭消耗Glc來減少體系中AA的生成，Tau/Glc體系發(fā)生的Maillard反應為該途徑提供了直接的依據(jù)［19］。另一條途徑是，Tau與 AA發(fā)生Michael親核加成反應生成AA－Tau加合物，這是反應的主要產(chǎn)物，此外還生成極少量的AA二聚體－Tau加合物。AA還有2個反應位點（共軛雙鍵和氨基），親電雙鍵能夠與Tau的氨基發(fā)生親核加成反應，生成的產(chǎn)物AA－Tau加合物還含有1個親核基團（NH），可以和另一分子的AA結合形成AA二聚體－Tau加合物［20］。此外，Tau的存在還促進了AA自身發(fā)生聚合作用，該結果與NaCl的作用相似［15］。

圖6 牛磺酸抑制丙烯酰胺生成的機理

3 結論

利用Asn/Glc模式反應體系證明，添加 Tau（1、5、10 mg/g）能夠顯著抑制體系中 AA的生成，Tau為10 mg/g時，抑制率最大達71.3%。抑制機理為：Tau既能夠與Glc發(fā)生美拉德反應，從而與Asn競爭消耗體系中的Glc，減少AA的生成；又能夠與AA直接發(fā)生親核加成反應，從而除去體系中已經(jīng)生成的AA，反應產(chǎn)物為AA－Tau加合物和AA二聚體－Tau加合物，前者生成量高于后者，這是Tau降低Asn/Glc模式體系中AA含量的主要反應途徑。同時，Tau還有助于促進AA的聚合反應，生成AA二聚體和AA三聚體，二聚體含量高于三聚體。通過模式反應體系推測證明，牛磺酸能夠有效地抑制富含淀粉的油炸、焙烤類食品中丙烯酰胺的含量。

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The Inhibitory Effect of Taurine on Acrylamide Rich in Starch－Enriched Food

Hao Ruifang1Jing Hao2
（Department of horticulture，Shanxi Forestry Vocational Technical College1，Taiyuan 030009）（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University2，Beijing 100083）

The inhibitory effect and mechanism of taurine（Tau）on acrylamide（AA）formation rich in starch－enriched food，by using asparagine/glucose（Asn/Glc）model system.The results showed that AA formation was effectively inhibited in Asn/Glc model system by taurine.LC－QTOFMS revealed twomain peaks in extracted ion chromatograms［M＋H］＋atm/z197 andm/z268 when AA was heated with Tau，which were identified as AA－Tau and AA dimmer－Tau adducts，respectively.The results also showed thatGlc contentwas effectively decreased when Glc was heated with Tau in Tau/Glcmodel system，which indicated thatGlc could react directly with Tau in themodel system.These results obtained by the above－mentioned model reaction systems demonstrated that taurine could reduce the content of acrylamide rich in starch－enriched food effectively.The inhibitory effect of Tau on AA formation was not onlymediated through reacting directly with AA to promote formation of AA－Tau and AA dimer－Tau adducts，but also reacting with Glc by Maillard reaction to contest consumption of Glc with Asn.

taurine，starch－enriched food，acrylamide，inhibitorymechanism

TS21

A

1003－0174（2015）08－0105－07

國家自然科學基金（31171676）

2014－02－14

郝瑞芳，女，1978年出生，講師，食品安全與質(zhì)量控制

景浩，男，1957年出生，教授，生物活性物質(zhì)與功能性食品