閻 君 陸智輝 祝水金 陳進(jìn)紅

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院/浙江省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

棉仁生育酚組成及其含量的高效液相色譜測(cè)定方法研究

閻 君 陸智輝 祝水金 陳進(jìn)紅

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院/浙江省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

優(yōu)化并建立了棉仁生育酚含量的快速提取技術(shù)及高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品用抗壞血酸和乙醇溶液處理后，正己烷超聲萃取，以正己烷/異丙醇（100/1）流動(dòng)相，采用C18色譜柱（ZORBAX?RX－SIL）等度洗脫，流速0.88mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)并定量（激發(fā)波長(zhǎng)300 nm，發(fā)射波長(zhǎng)330 nm）。測(cè)得4種生育酚的回歸方程R2在0.990～0.999之間，線性關(guān)系良好；4種生育酚精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n＝5）均小于1%，加標(biāo)回收試驗(yàn)的平均回收率范圍在90%～105%之間，RSDs（n＝3）低于7%；方法檢出限范圍為0.1～0.2μg/mL，定量限為0.2～0.5μg/mL。該方法作為棉仁生育酚的快速測(cè)定方法，準(zhǔn)確、快捷、選擇性好，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

棉仁 生育酚 高效液相色譜

生育酚是一類含有多甲基化的兩親性酚類有機(jī)物，目前認(rèn)為由α－生育酚（α－VE）、β－生育酚（β－VE）、γ－生育酚（γ－VE）、δ－生育酚（δ－VE）與α－生育三烯酚、β－生育三烯酚、γ－生育三烯酚、δ－生育三烯酚8種構(gòu)型和理化性質(zhì)相似、活性不同的異構(gòu)物組成。棉籽中富含生育酚（VE），而棉仁是棉籽中生育酚的主要貯藏部位，是天然生育酚的一個(gè)巨大潛在資源，亟待開展資源評(píng)價(jià)與開發(fā)利用研究。作為評(píng)價(jià)研究的基礎(chǔ)，需要建立準(zhǔn)確、快捷的分離與測(cè)定方法。吳時(shí)敏等［1］研究表明在菜籽油提取過(guò)程中，其中的生育酚、α－生育酚含量與α－生育酚占生育酚的比例均降低；花生油等各種植物油在加工過(guò)程中VE含量會(huì)發(fā)生變化［2－3］。棉仁中的各種生育酚異構(gòu)體以混合物的形式存在，在其皂化、提取、濃縮過(guò)程中極易被某些脂肪酸生成的衍生物破壞或在高溫環(huán)境下氧化而發(fā)生損耗，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，需要優(yōu)化建立適合棉仁生育酚提取、皂化、濃縮及測(cè)定的相應(yīng)方法。

生育酚的定性與定量方法，主要有比色法［4－5］、光譜法［6－7］、電化學(xué)法［8－9］以及色譜法［10－13］等技術(shù)。熒光法測(cè)定不同的樣品前處理步驟不同，程序比較繁瑣，且在VE含量少于100μg/mL條件下其熒光強(qiáng)度和濃度間難以建立線性關(guān)系；分光光度法可定量測(cè)定VE，但測(cè)定的結(jié)果受樣品本身還原劑如VC等的干擾，且試劑空白影響較大，必須校正；雙波電壓法檢測(cè)限為20μg/mL，靈敏度稍低；示波法則只能測(cè)定總VE，不能將各種單體分開。高效液相色譜技術(shù)（HPLC）以其靈敏度高、分離效果顯著、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生育酚的測(cè)定研究中。

目前HPLC法雖然在油菜籽、大豆等作物生育酚的測(cè)定應(yīng)用較多，但不同測(cè)定對(duì)象，采用的HPLC體系也不盡相同；同時(shí)，在棉仁中生育酚含量的HPLC測(cè)定研究較為少見，能夠明顯分離棉仁中α、β、γ和δ4種生育酚的研究更是不多。李躍紅等［14］用氫氧化鉀、乙醇體系將生育酚皂化后乙醚提取，分離出α－VE和δ－VE，但無(wú)法在該色譜條件下將β－VE與γ－VE分開，在γ－VE峰中包含β－VE。彭光華等［15］用正己烷溶劑浸提法，提取并測(cè)出油菜籽中生育酚的含量，效果良好。馬戎等［16］用飽和抗壞血酸乙醇溶液萃取樣品，測(cè)定煙草中生育酚的含量。商軍等［17］采用 C18反相柱，甲醇∶水 ＝98∶2為流動(dòng)相，測(cè)定飼料中VE的含量。

本研究從提取工藝、色譜條件改進(jìn)等方面入手，優(yōu)化樣品處理方法和檢測(cè)條件，建立快速準(zhǔn)確測(cè)定棉仁生育酚的HPLC方法，以期為棉仁生育酚資源的評(píng)價(jià)利用與進(jìn)一步提高棉副產(chǎn)品的利用率、更好地開展棉花品質(zhì)育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉籽樣品來(lái)自于統(tǒng)一種植在浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站2012年的6個(gè)棉花種質(zhì)：TM－1、交力大花、徐州142、徐州142無(wú)絮、n2、GZNn2－1以及2013年的3個(gè)棉花種質(zhì)：n2、GZNn2－1、交力大花。其中TM－1種質(zhì)由浙江大學(xué)作物研究所提供，其他種質(zhì)由中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所國(guó)家棉花種質(zhì)中期庫(kù)提供。

1.2 主要儀器

Agilent1100系列高效液相色譜儀、C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱：美國(guó) Agilent公司；UV－1800型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 主要試劑

正己烷（AR）、無(wú)水乙醇（AR）、抗壞血酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；正己烷（HPLC）、異丙醇（HPLC）：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；α－、β－、γ－、δ－生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma試劑公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

剝干燥的棉籽取棉仁，粉碎，在30℃恒溫箱中烘干備用。

稱取0.100 0 g棉仁粉置于15 mL離心管中，加入0.05 g抗壞血酸和3mL、80%的乙醇溶液，振蕩均勻，置于超聲波清洗儀中30℃、功率240 W超聲10 min，加入6 mL正己烷，振蕩均勻，封口膜封口，－20℃溫度下靜置15 h。取出后超聲40 min充分提取，然后6 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行0.45μm微孔抽濾，獲得生育酚的提取液，低溫避光保存。

1.4.2 生育酚標(biāo)樣儲(chǔ)備液的配置和工作曲線

準(zhǔn)確稱取一定量的α－、β－、γ－、δ－生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，正己烷為溶劑，分別配制成10 000、1 000、100、10μg/mL的儲(chǔ)備液，避光低溫保存。分別以 α－、β－、γ－、δ－生育酚的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其回歸方程。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX? RX－SIL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，ex＝300 nm、em＝330 nm；流動(dòng)相：正己烷∶異丙醇 ＝100∶1；柱溫：23℃；流速：0.88 mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理技術(shù)

2.1.1 提取溶劑

生育酚呈弱酸性，易溶于乙醇、乙醚、正己烷等有機(jī)溶劑。溶劑對(duì)樣品的穩(wěn)定性有一定影響，某些溶劑與目標(biāo)物質(zhì)形成耦合物，而生育酚在一些溶劑中容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異，所以在選擇溶劑時(shí)，應(yīng)考慮樣品的穩(wěn)定性、安全性和分離度。

通過(guò)對(duì)甲醇、乙醇、正己烷等溶液作為溶劑的比較研究發(fā)現(xiàn)，生育酚在醇類物質(zhì)中不穩(wěn)定，不利于其在色譜柱中的分離，而在正己烷溶液中，樣品的穩(wěn)定性較好、分離度高，且峰形理想（圖1）。

圖1 4種生育酚的高效液相色譜圖

2.1.2 靜置處理

在生育酚的提取過(guò)程中，不同研究者采用的方式不同。劉敏軒等［18］用2，6－二叔丁基對(duì)甲酚、乙醇、抗壞血酸和KOH進(jìn)行皂化，后用正己烷∶乙酸乙酯 ＝85∶15提?。粡埞鹪频龋?9］用無(wú)水乙醇、鄰苯三酚、NaCl和KOH溶液混勻樣品，后加入正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1提?。唤觽ス獾龋?0］用乙醇、沒食子酸以及KOH溶液皂化后，采用5%NaCl＋石油醚提取樣品中的生育酚。綜合比較，本研究在參照劉煥成等［21］的方法基礎(chǔ)上，增加了6 mL正己烷中暗處?kù)o置15 h的處理。與未靜置組相比，暗處?kù)o置15 h后可使生育酚提取更充分，見表1。

表1 靜置15 h處理對(duì)測(cè)定結(jié)果影響

2.1.3 超聲時(shí)間

稱取0.100 0 g棉仁粉樣品21份，分成7組，每組平行測(cè)定3次，置于15 mL離心管中，加入0.05 g抗壞血酸和3 mL、80%的乙醇溶液，振蕩均勻，后置于超聲波清洗儀中30℃、功率240 W超聲10 min，加入6 mL正己烷，振蕩均勻，封口膜封口，放在－20℃溫度下靜置15 h。取出后置于超聲機(jī)中再分別超 聲 20、25、30、35、40、45、50 min，離 心 機(jī)6 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行0.45μm微孔抽濾。測(cè)定結(jié)果表明：隨超聲時(shí)間增加，棉仁粉中的生育酚逐漸被提取出來(lái)，超聲時(shí)間超過(guò)40 min后生育酚含量增加趨勢(shì)平緩（圖2）。綜合考慮提取率與低能耗，選擇超聲提取時(shí)間40 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)不同生育酚測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

生育酚的吸收波長(zhǎng)在220～400 nm之間。分別利用α－、β－、γ－、δ－生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的配制液以及混合溶液在220～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明：不同種生育酚及生育酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物均在300 nm附近有最大吸收值（圖3）。因此認(rèn)為，檢測(cè)波長(zhǎng)可采用300 nm。

圖3 生育酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物檢測(cè)波長(zhǎng)

2.3 液相色譜條件

2.3.1 色譜柱

為選擇合適的色譜柱，本研究對(duì)Agilent ZORBAX SBC18（4.6mm×150mm，5μm）和Agilent ZORBAX RX－SIL C18（4.6 mm×250 mm，5μm）2種色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明ZORBAX SB C18色譜柱分析時(shí)間過(guò)短，分離效果比ZORBAX RX－SIL C18色譜柱差一些，故選擇 Agilent ZORBAX RX－SIL C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱。

2.3.2 流動(dòng)相

生育酚的洗脫速度隨正己烷/異丙醇的比例的增加而減緩，從而保留時(shí)間加長(zhǎng)。為了找到最佳流動(dòng)相配比，比較了正己烷∶異丙醇 ＝98∶1、99∶1、100∶1的3種條件下的測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明以正己烷∶異丙醇＝100∶1的配比作為流動(dòng)相時(shí)目的峰與其他雜質(zhì)峰分離度好，且分析時(shí)間也比較適宜（圖4）。

圖4 不同流動(dòng)相比例條件的生育酚色譜圖

2.3.3 流速

流速會(huì)影響分析時(shí)間的長(zhǎng)短以及目的峰的分離情況。為確定適合的流速，本研究比較了1.2、1.0和0.88 mL/min 3個(gè)流速下的樣品分離效果，結(jié)果表明：當(dāng)流速為0.88 mL/min時(shí)，目的峰分離度好、分析時(shí)間適宜（圖5）。

圖5 不同流速條件的生育酚色譜圖

2.4 線性關(guān)系

取適量α、β、γ、δ－生育酚儲(chǔ)備液配制成（1.0、0.1、0.5、0.1μg/mL），（2.0、0.2、1.0、0.2μg/mL），（5.0、0.4、5.0、0.4μg/mL），（10.0、0.8、10.0、0.8 μg/mL）和（20.0、1.0、20.0、1.0μg/mL）5個(gè)梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，上樣分析。以相應(yīng)質(zhì)量濃度x（μg/mL）對(duì)峰面積y做回歸分析。以S/N≥3確定方法的檢出限（LOD）；以S/N≥10確定方法的定量限。結(jié)果見圖6，表2說(shuō)明4種生育酚異構(gòu)體分別在1.0～20.0、0.1～1.0、0.5～20.0和0.1～1.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限范圍在0.1～0.2μg/mL，定量限范圍是0.2～0.5μg/mL。

圖6 4種生育酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 生育酚線性回歸方程

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取0.1 g樣品5份，按照1.4.1方法進(jìn)行樣品中生育酚的提取。如表3所示，由所得的目的峰面積計(jì)算相應(yīng)樣品的α、β、γ、δ－生育酚含量平均值分別為13.38、0.37、4.28和 2.67 mg/100 g，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.62、4.28、2.53和4.05%，均小于10%，參照ISO 9936－2006中關(guān)于重復(fù)性檢測(cè)的說(shuō)明，經(jīng)計(jì)算得到樣品中α、β、γ、δ－生育酚重復(fù)性限以及每2次重復(fù)性數(shù)據(jù)的絕對(duì)差值，其中α、γ、δ絕對(duì)差值均低于重復(fù)性限，β的絕對(duì)差值雖稍大，但相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差已符合標(biāo)準(zhǔn)要求，因此，可以認(rèn)為此方法具有較好的精密度，符合檢測(cè)要求。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品混合樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，以α－、β－、γ－、δ－生育酚的測(cè)定值來(lái)考察測(cè)定儀器的精密度。從表4可知：5次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.59%、0.74%、0.9%、0.7%，均小于1%，說(shuō)明該儀器的重現(xiàn)性好。

表4 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

生育酚是抗氧化劑，在空氣中暴露時(shí)間太久會(huì)氧化分解。為保證生育酚測(cè)定的準(zhǔn)確性，本研究選取4個(gè)不同品種的棉仁粉，在樣品提取后的24 h內(nèi)分時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明：4個(gè)樣品在配置后的24 h內(nèi)，α－、β－、γ－VE的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，而δ－T的RSD較大，但也均小于10%（表5）。說(shuō)明棉籽中生育酚的測(cè)定在24 h內(nèi)是相對(duì)穩(wěn)定可信的。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.8 回收率試驗(yàn)

參照商軍等［17］、彭光華等［15］、馬戎［16］等回收率試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案，稱取3份生育酚含量已知的棉仁粉樣品0.1 g，每份平行測(cè)定3次，按照1.4.1的方法提取生育酚后，取5 mL提取液，設(shè)置α－、β－、γ－、δ－生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度梯度為0.5、0.05、0.1、0.05μg/mL，2.0、0.2、0.5、0.2μg/mL，和 5.0、0.5、2.0、0.5μg/mL。在1.4.3的 HPLC條件下，計(jì)算回收率。結(jié)果表明：α－、β－、γ－、δ－T的平均回收率均在90%～105%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在7%之內(nèi)（表6），說(shuō)明樣品的處理方法得當(dāng)，回收率高，準(zhǔn)確性好。

表6 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)/%

2.9 與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)法（ISO 9936—2006）的比較

參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布的ISO 9936—2006測(cè)定方法（以下簡(jiǎn)稱“ISO法”），利用2013年種植獲得的3個(gè)不同品種的棉仁樣品，與本方研究?jī)?yōu)化建立的方法進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明（表7）采用本研究?jī)?yōu)化建立的方法，3個(gè)品種各成份測(cè)定值均高于ISO法?？赡茉颍阂皇潜痉椒ㄔ诒ＷC4種生育酚均能檢測(cè)到的情況下，樣品量?jī)H0.1 g，而ISO法的樣品量要求為2 g，較多的樣品可能容易造成生育酚未被充分提??；二是本方法在添加無(wú)水乙醇和還原劑抗壞血酸后振蕩離心，反應(yīng)過(guò)程緩慢，且密閉性較好，較好地避免樣品中的生育酚被氧化損耗，而ISO法在氮?dú)猸h(huán)境中通入氫氧化鉀，樣品迅速發(fā)生反應(yīng)，操作過(guò)程中容易混入空氣氧化部分生育酚，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。這說(shuō)明，采用本研究?jī)?yōu)化建立的方法對(duì)棉仁生育酚含量及組分的測(cè)定比較精確。

表7 ISO 9936—2006法與本試驗(yàn)方法的測(cè)定比較

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化并建立了高效液相色譜－紫外檢測(cè)法快速測(cè)定棉仁生育酚的方法，能將生育酚的各成分完全分離并定量。具體方法為：樣品用抗壞血酸和乙醇溶液處理后，以正己烷為提取溶劑，暗處?kù)o置15 h后超聲萃取40 min，離心分離；采用Agilent色譜柱 C18（250 mm×4.6 mm，5μm），以正己烷∶異丙醇 ＝100∶1為流動(dòng)相，流速 0.88 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，柱溫23℃。檢測(cè)結(jié)果表明，棉仁中4種生育酚的回歸曲線R2在0.990～0.999之間，在檢測(cè)濃度內(nèi)線性關(guān)系良好；各指標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以下，平均回收率為90%～105%，檢出限范圍是 0.1～0.2μg/mL，定量限為0.2～0.5μg/mL。說(shuō)明該方法作為棉仁生育酚的測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷、選擇性好，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

志謝：本研究的高效液相色譜分析得到浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物985平臺(tái)分析測(cè)試中心的支持，周希同學(xué)參與了樣品準(zhǔn)備及具體的測(cè)試操作等工作，在此特表感謝。

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Determination Method of Composition and Content of Tocopherol in Cottonseed Kernels by High Performance Liquid Chromatography

Yan Jun Lu Zhihui Zhu Shuijin Chen Jinhong
（College of Agriculture and Biotechnology of Zhejiang University，Zhejiang Province Key Laboratory of Crop Germplasm Resource，Hangzhou 310058）

The rapid extraction technology of tocopherol from cottonseed kernels and the high performance liquid chromatography（HPLC）determination method for tocopherol content are built and optimized in the study.After dissolved in ascorbic acid and ethanol，the analytes were ultrasonically extracted by n－h(huán)exane.The four types of tocopherolwere separated by using ZORBAX4? RX－SIL C18 column with themobile phase of n－h(huán)exane and isopropanol under isocratic elution，and finally detected and quantified by ultraviolet detector（excitation wavelength＝300 nm，emission wavelength＝330 nm）.Under the optimal conditions，themultiple correlation coefficients（R2）of the four isomers of tocopherolwere among 0.990～0.999.The relative standard deviation（RSDs，n＝5）of precision test resultswere lower than 1%，and the average of recovery ratio ranged from 90%to 105%with RSDs（n＝3）lowing 7%.The detection limits and quantification limits of the method for four isomers of tocopherol were 0.1～0.2 μg/mL and 0.2～0.5μg/mL respectively.The results demonstrate that the determination method as rapid determination method of totaxin of cottonseed kernelsmentioned above is easy，efficient，accurate and with high practical value.

cottonseed kernels，tocopherol，high performance liquid chromatography

O657.7

A

1003－0174（2015）08－0120－07

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技專項(xiàng)（2013ZX08005－005）

2014－02－20

閻君，女，1989年出生，碩士，作物品質(zhì)形成與調(diào)控

陳進(jìn)紅，男，1964年出生，副教授，作物品質(zhì)形成與調(diào)控