陳忠軍，高鶴塵，李?，u

（內蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程，呼和浩特010018）

0 引言

乳桿菌是一類能從可發(fā)酵碳水化合物（主要指葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的細菌的總稱[1]。乳酸菌作為重要的益生菌已廣泛地用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)中,被公認為是安全的(generally regarded as safe,GRAS)食品級微生物[2]，歷來被用作食品的天然生物防腐劑。天然防腐劑具有安全無毒、抗菌性強、水溶性好、耐熱性好、應用范圍廣等優(yōu)點,這是合成防腐劑所無法比擬的[3]。乳酸菌可以產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、細菌素等多種天然抑菌物質[4-6],抑制一些腐敗菌或致病菌的生長。延長食品的貨架期[11-12]。目前主要被認定的有效抑真菌物質有：有機酸、羅氏菌素、過氧化氫、蛋白類短肽、羥基脂肪酸等、和酚類化合物[7]。

本研究旨在篩選出對酵母有抑制作用的乳酸菌，對其產(chǎn)生的抑菌活性物質的特性進行研究，為進一步提取和純化抑菌活性物質奠定基礎[8]。

1 實驗

1.1 材料

（1）乳酸菌為ALAC-1，ALAC-2，ALAC-3，ALAC-4，ALAC-5。指示菌為白假絲酵母（Candidaalbicans)。

（2）乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，指示菌培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基，抑菌活性檢測培養(yǎng)基，水瓊脂培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基。

（3）試劑：過氧化氫酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，蛋白胨，牛肉膏，大豆蛋白胨，酵母提取粉，胰蛋白胨，無水乙酸鈉，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸錳，檸檬酸氫二銨，NaOH，無水葡萄糖，其他化學試劑。

（4）儀器：移液器；FLC—3型超凈工作臺，BCD—221BSY冰箱，HVE—50型全自動高壓滅菌鍋，HPS—250生化培養(yǎng)箱，12001型上皿電子天平，旋轉蒸發(fā)儀，LG10—2.4A型離心機。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌代謝產(chǎn)物的制備

將穿刺保藏的乳酸菌接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中活化一代，37℃培養(yǎng)16～24 h，將發(fā)酵后的發(fā)酵液離心（3 000 r/min，10 min），將上清液用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮至25倍，取濃縮液進行實驗[9]。

1.2.2 指示菌菌懸液的制備

將斜面保藏的白假絲酵母菌用滅菌后的接種環(huán)挑到滅菌的生理鹽水中，調至濃度為102mL-1，并混勻，得到供試菌懸液。

1.2.3 抑菌活性的測定

用牛津杯法將融化的水瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，每個10 mL左右，待凝固后，將滅菌后的牛津杯用滅菌后的鑷子放在水瓊脂上。然后將含有酵母的TSB固體培養(yǎng)基倒入平皿中，每個25 mL左右。待TSB凝固后，取出牛津杯，加入200 μL的乳酸菌濃縮液，30℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺量取抑菌圈直徑（包含牛津杯外徑（7 mm）取平均值后的數(shù)據(jù)為準）。

1.2.4 乳桿菌排酸后的抑菌效果

將5株乳酸菌的發(fā)酵液用濃度為1 mol/L的NaOH調至pH值為4.5，5.0，5.5后，經(jīng)離心旋轉蒸發(fā)濃縮25倍，取濃縮液測定抑菌活性。

1.2.5 代謝產(chǎn)物熱處理后的抑菌效果

將篩選的乳酸菌的發(fā)酵液分別置于45，55，70，85，100℃的水浴鍋中處理10 min，離心（4 000 r/min，10 min），將上清液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮25倍，測定其抑菌活性，同時設未經(jīng)處理的代謝產(chǎn)物作為對照。

1.2.6 代謝產(chǎn)物紫外線輻射后的抑菌效果

將乳酸菌的發(fā)酵液分別經(jīng)過5，10，15，20，25 min的紫外線射線輻射，（其瓦數(shù)為150 w，電源電壓AC220V/50Hz），離心，將上清液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮25倍，測定其抑菌活性，同時設未經(jīng)處理的代謝產(chǎn)物作為對照。

1.2.7 代謝產(chǎn)物經(jīng)金屬離子處理后的抑菌效果

將 K+，Na+，Mg2+，Mn2+，Ca2+金屬離子分別加入到乳酸菌培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，離心（4 000 r/min，10 min），將上清液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮25倍，測定其抑菌活性，同時設未經(jīng)處理的代謝產(chǎn)物作為對照。

1.2.8 代謝產(chǎn)物經(jīng)酶處理后的抑菌效果

將所用酶用磷酸鹽緩沖液(pH值為7.2,濃度為1 mol/mL)配制成質量濃度0.5g/L酶液。用濃度為5 mol/L的NaOH和HCl調至各酶最適pH值（表1）。取濃縮代謝產(chǎn)物3 mL，分別加入過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K酶液0.5，1，1.5，2 mL，在37℃下反應2 h后，調pH值至代謝產(chǎn)物初始pH值。并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原始體積，測定其抑菌活性，同時設未經(jīng)處理的代謝產(chǎn)物作為對照。

2 結果與分析

2.1 經(jīng)排酸后乳桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性

以酵母菌為指示菌，將5株乳酸菌代謝產(chǎn)物經(jīng)排酸后測定其抑菌活性，結果如表2所示。

表2 不同pH值的抑菌圈的直徑 mm

由表2可以看出，5株乳酸菌代謝產(chǎn)物對酵母菌均有抑制作用。其中ALAC-1，ALAC-2，ALAC-5在pH值為4.5以上對指示菌無抑菌效果，說明抑菌活性物質可能為酸。ALAC-3和ALAC-4分別在pH值為5.0和pH值為5.5時仍有抑菌效果，說明抑菌活性物質除了酸還有其他抑菌物質的存在。所以，在后期實驗中，將ALAC-3和ALAC-4作為實驗菌株。

2.2 代謝產(chǎn)物熱處理后的抑菌活性

以酵母菌為指示菌，將ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物分別經(jīng)過45，55，65，75，85 ℃處理10 min后，測定抑菌活性，結果如圖1所示。

圖1 ALAC-3和ALAC-4在不同溫度處理下的抑菌效果

由圖1可以看出，代謝產(chǎn)物經(jīng)過 45，55，65，75，85℃不同溫度處理后，抑菌活性均有一定程度的下降。ALAC-3菌株在55℃處理時抑菌活性達到最低值，抑菌圈為23.61 mm，仍有抑菌性。ALAC-4菌株的抑菌活性隨著溫度升高緩慢的下降，但抑菌圈仍在30 mm左右，仍有較強的抑菌性。說明2株菌所產(chǎn)抑菌活性物質具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3 代謝產(chǎn)物紫外線輻射后的抑菌效果

以酵母菌為指示菌，ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物分別經(jīng)過5，10，15，20，25 min紫外線輻射后，測定抑菌活性，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，ALAC-3菌株代謝產(chǎn)物經(jīng)過紫外線輻射不同的時間后，抑菌圈直徑呈下降的趨勢。經(jīng)25 min處理后，抑菌圈由最初的33.47 mm降為28.87 mm，下降了13.74%，仍有較強的抑菌性。ALAC-4菌株經(jīng)過輻射不同的時間后，抑菌圈直徑到10 min上升，10 min后總體呈下降的趨勢。處理25 min后，抑菌圈由最初的34.91 mm降為23.96mm，下降了31.37%，仍有較強的抑菌性。說明ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物對于紫外線輻射不是很敏感。

圖2 ALAC-3和ALAC-4在紫外線輻射后的抑菌效果

2.4 代謝產(chǎn)物經(jīng)金屬離子處理后的抑菌效果

以酵母菌為指示菌，在ALAC-3和ALAC-4菌株培養(yǎng)基中分別加入K+，Na+，Mg2+，Mn2+，Ca2+后進行發(fā)酵，測定抑菌活性，結果如圖3所示。

圖3 金屬離子對ALAC-3和ALAC-4抑菌效果的影響

由圖3可以看出，Ca2+和Mn2+對ALAC-3代謝產(chǎn)物的抑菌作用起促進作用；而加入K+，Na+，Mg2+的ALAC-3抑菌圈直徑明顯小于未處理的，說明K+，Na+，Mg2+對ALAC-3代謝產(chǎn)物的抑菌作用起抑制作用。ALAC-4加入K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+后，抑菌圈直徑明顯小于未處理的，說明K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+對ALAC-4代謝產(chǎn)物的抑菌作用起抑制作用。

2.5 代謝產(chǎn)物經(jīng)酶處理后的抑菌效果

添加不同量的酶后，測定抑菌活性。進行比較后，將1mL作為酶的最適添加量。以酵母菌為指示菌，過氧化氫酶處理ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物，測定抑菌活性，結果見圖4。排除過氧化氫干擾后，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K處理ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物，測定抑菌活性，結果如圖5和圖6所示。

圖4 ALAC-3和ALAC-4經(jīng)過氧化氫酶處理后的抑菌活性

由圖4可以看出，ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌活性都有所降低。ALAC-3由22.79 mm降為16.61 mm，下降了27%。而ALAC-4由26.13 mm降為12.61 mm，下降了52%，說明過氧化氫是抑菌物質中的一種成分。排除了過氧化氫的干擾后，其代謝產(chǎn)物仍有抑菌活性，說明抑菌物質中還有其他起抑菌作用的成分。

圖5 ALAC-3經(jīng)過不同蛋白酶處理后的抑菌活性

圖6 ALAC-4經(jīng)過不同蛋白酶處理后的抑菌效果

由圖5和圖6可以看出，ALAC-3和ALAC-4菌株代謝產(chǎn)物經(jīng)過木瓜蛋白酶處理，抑菌活性分別降低了42%和18%；蛋白酶K處理后，ALAC-3的抑菌活性沒有受到影響，ALAC-4抑菌活性降低了8%；胰蛋白酶處理后，抑菌活性分別降低了63%和43%；胃蛋白酶處理后，抑菌活性分別降低了16%和21%。說明ALAC-3和ALAC-4代謝產(chǎn)物對蛋白酶敏感，所以抑菌物質可能是一種蛋白類物質。

3 討論

本研究以酵母菌為指示菌，經(jīng)排酸篩選出兩株具有抑酵母作用的乳酸菌ALAC-3和ALAC-4。兩株乳酸菌在排除酸的影響后仍有抑菌效果，說明代謝產(chǎn)物中除了酸以外，還有其它抑菌物質的存在。ALAC-3、ALAC-4代謝產(chǎn)物經(jīng)不同溫度處理后，抑菌活性略有降低，說明其熱穩(wěn)定性較好，且對紫外線輻射不太敏感。Ca2+和Mn2+對ALAC-3代謝產(chǎn)物的抑菌作用起促進作用，而K+，Na+，Mg2+對其抑菌作用起抑制作用。K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+對ALAC-4代謝產(chǎn)物的抑菌作用都起抑制作用。排除過氧化氫干擾后，菌株代謝產(chǎn)物仍有抑菌活性，說明代謝產(chǎn)物產(chǎn)物中除了酸和過氧化氫，還存在其他抑菌物質。代謝產(chǎn)物經(jīng)木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，抑菌活性有不同程度的降低，說明抑菌物質對蛋白酶敏感，有可能是一種蛋白類的抑菌物質。目前，人們發(fā)現(xiàn)的具有抑真菌活性的乳酸菌能產(chǎn)生有機酸、

過氧化氫以及一些其它具有抑真菌作用的低分子量化合物[10]。但是對于乳酸菌產(chǎn)生的蛋白質類抑真菌作用的研究甚少，所以本實驗為進一步分離純化蛋白類抑菌物質以及其結構的確定奠定了基礎。

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