·綜述·

生物活性肽-單核細(xì)胞遷移抑制因子研究進(jìn)展

程浩1，芮耀誠2，章越凡2，李鐵軍1,2(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433)

[摘要]單核細(xì)胞遷移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor，MLIF)是阿米巴原蟲產(chǎn)生的具有抗炎作用的五肽。體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，MLIF可以發(fā)揮抗炎和免疫保護(hù)作用，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷、心肌缺血、腦缺血及癡呆具有良好的保護(hù)作用。研究證明MLIF通過NF-κB 和MAPK信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫保護(hù)。筆者對MLIF的來源和生物活性做一綜述。

[關(guān)鍵詞]單核細(xì)胞遷移抑制因子；炎癥；免疫；生物活性肽

[基金項(xiàng)目]國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目：防治心肌缺血的抗炎短肽候選化合物研究(2013ZX09103001-005)

[作者簡介]程浩，碩士研究生.Tel：15026671908；E-mail：chenghao4433@163.com

[通訊作者]李鐵軍，博士，副教授.研究方向：心腦血管藥理.Tel:(021)81871236；E-mail：ltj204@163.com

[中圖分類號]R96[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.005

[收稿日期]2014-08-11[修回日期]2014-11-05

Research progress of bioactive peptide monocyte locomotion inhibitory factor

CHENG Hao1，RUI Yaocheng2，ZHANG Yuefan2，LI Tiejun1，2(1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China ；2.Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract[]Monocyte locomotion inhibitory factor(MLIF)was an anti-inflammatory pentapeptide produced by Entamoeba histolytica.In vivo and in vitro study showed that MLIF displayed anti-inflammatory and immune protection effects and MLIF had protective effects on rheumatoid arthritis，nerve injury，myocardial ischemia，cerebral ischemia and Alzheimer′s disease.Studies had shown that MLIF regulated inflammatory response and immune protection through NF-κB and MAPK signal pathways.The sources and biological activities of MLIF were reviewed in this paper.

[Key words]monocyte locomotion inhibitory factor；inflammation；immune；bioactive peptide

肽是氨基酸彼此之間以酰胺鍵相互連接的化合物，由于肽的相對分子質(zhì)量較小，并具有各種生物學(xué)活性，所以又被稱為生物活性肽。生物活性肽易消化吸收，微量的狀態(tài)下就能發(fā)揮強(qiáng)大的生理活性，具有神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、降血壓、降血脂、抗癌等作用[1]。1986年，美國科學(xué)家斯坦利·科恩(Stanley Cohen)和麗塔·列維-蒙塔爾奇尼(Rita Levi-Montalcini)因發(fā)現(xiàn)生長因子而獲得諾貝爾生理學(xué)獎(或醫(yī)學(xué)獎)。單核細(xì)胞遷移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor，MLIF)是由5個氨基酸組成的寡肽，自1985年發(fā)現(xiàn)以來[2]，報道MLIF的外文文獻(xiàn)已有30多篇，但未見中文文獻(xiàn)報道。筆者對MLIF的來源和生物活性做一綜述。

1MLIF的來源及理化性質(zhì)

MLIF是在無菌培養(yǎng)的溶組織內(nèi)阿米巴上清液中發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定化合物，經(jīng)過超濾，凝膠色譜分離和HPLC純化，通過Edman降解法和質(zhì)譜法確定MLIF的一級結(jié)構(gòu)為Met-Gln-Cys-Asn-Ser(相對分子質(zhì)量581)。MLIF以單倍體和二倍體兩種形式存在，人工合成的五肽與原生產(chǎn)物具有相同的抗炎活性。但是研究發(fā)現(xiàn)向溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)基中加入蛋白酶抑制劑，上清液中并未檢測到MLIF的活性，因此，推測MLIF可能不是溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)基的降解產(chǎn)物，而是由大分子蛋白剪切所得[3]。研究表明[2]，MLIF可以在體內(nèi)外抑制人單核細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的遷移，而對嗜中性多形核白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞沒有影響，因此得名單核細(xì)胞遷移抑制因子——MLIF。

Jiang 等[4]建立了LC-MS/MS方法檢測MLIF，測得比格犬血液中MLIF的半衰期為0.4~0.5 min，由此可以看出MLIF的半衰期極短，可能與生物基質(zhì)中的蛋白水解酶容易使多肽類快速降解有關(guān)。另外，MLIF含有兩個極易發(fā)生氧化的氨基酸殘基甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)，這也使MLIF在體內(nèi)代謝迅速。然而，在室溫條件下，MLIF可以在0.2%的甲酸和50%(V/V)的甲醇中穩(wěn)定地存在8 h。

2MLIF的生物活性

2.1　抗炎作用

炎癥是指機(jī)體對感染、外來物質(zhì)或者其他原因所致?lián)p傷的一種反應(yīng)，炎癥反應(yīng)有利于損傷的減輕和修復(fù)，其中趨化因子和細(xì)胞因子與炎癥細(xì)胞的相互作用構(gòu)成了炎癥反應(yīng)的重要組成部分。早期的急性炎癥過程伴隨著單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而在患有腸病的患者中，小于1%的是由阿米巴肝膿腫引起的，提示炎癥過程伴隨著阿米巴病，阿米巴原蟲可以產(chǎn)生并釋放促/抗炎因子抑制白細(xì)胞向病灶處移動。

MLIF可以通過抑制黏附分子、趨化因子和其他因子(如IL-1β)的表達(dá)來抑制單核細(xì)胞的遷移和呼吸爆發(fā)，降低皮膚的超敏反應(yīng)并延遲人皮膚中單核細(xì)胞向炎癥區(qū)域的遷移。在豚鼠的炎癥實(shí)驗(yàn)中[5]，MLIF可以抑制單核吞噬細(xì)胞黏附分子VLA-4和VCAM-1的表達(dá)，也可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1的表達(dá)[6]。Godina-Gonzalez等[6]的體內(nèi)試驗(yàn)表明，MLIF通過下調(diào)細(xì)胞黏附分子、炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶來減輕急性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)。Velázquez等[7]的體外實(shí)驗(yàn)表明，MLIF可以降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血單個核細(xì)胞的IL-1β表達(dá)水平，而在LPS刺激的U-937細(xì)胞上清液中未檢測到相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MLIF的部分體內(nèi)代謝產(chǎn)物二肽Met-Gln、四肽Gln-Cys-Asn-Ser也有抗炎作用，可以抑制IL-1β、IFN-γ、IL-5和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)[8]。

另外，Utrera-Barillas等[9]在PMA刺激的U-937細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，MLIF對趨化因子MIP-1α、MIP-1β和細(xì)胞因子IL-1β有顯著的抑制作用，IL-8和趨化因子CCL1以及趨化因子受體CCR1的表達(dá)也相應(yīng)降低。提示MLIF的抑制作用不僅可以直接作用于炎癥細(xì)胞，也可通過下調(diào)內(nèi)源促炎趨化因子的聚合來發(fā)揮作用。

MLIF的抗炎作用在不同的階段表現(xiàn)不同，它可以改變促炎和抗炎過程中的信號通路，有些基因在正常的生化條件下就可以產(chǎn)生作用，而有些則在刺激后才表達(dá)。如Silva-García等[10]利用基因芯片研究了PMA刺激的U-937細(xì)胞中編碼人細(xì)胞因子、受體和相關(guān)因子的基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示，在總的基因變化中，上調(diào)的基因比下調(diào)的基因少，提示以抑制作用為主。其中在所研究的375個基因中，MLIF影響了正常情況下U-937細(xì)胞中的17個基因的表達(dá)，而影響PMA誘導(dǎo)的細(xì)胞中22個基因的變化。

在機(jī)體防御體系中，NF-κB途徑是一種保守的、基本的防護(hù)體系，它可以激發(fā)并參與調(diào)節(jié)先天性的免疫調(diào)節(jié)作用。NF-κB途徑經(jīng)激活后主要影響細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12等)、趨化因子(如IL-8、MIP-1α、MIP-1β等)、黏附分子(如ICAM、VCAM)和酶(如iNOS、COX-2)的合成，其中的大部分參與炎癥過程。MAPK途徑也可以參與炎癥基因的調(diào)節(jié)，其中調(diào)節(jié)的產(chǎn)物主要包括細(xì)胞因子、表面受體和黏附分子。當(dāng)MAPK被激活后，p38參與轉(zhuǎn)錄水平的炎癥調(diào)節(jié)，產(chǎn)生了一個潛在的抗炎治療靶點(diǎn)。

目前尚未完全了解MLIF發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制。有文獻(xiàn)報道[10]，MLIF通過參與NF-κB和MAPK信號途徑來改變免疫應(yīng)答中相關(guān)分子的表達(dá)，并偏向于Th2型應(yīng)答。在眾多變化的基因中，IL-8、MIP-1α、MIP-1β參與NF-κB信號通路的調(diào)控，而FGF-10、IL-5R、OSMR β和IL-10則與MAPK信號通路的調(diào)控有關(guān)，其中IL-1β在兩條信號通路中都起作用，說明MLIF至少參與了以上兩條信號通路來發(fā)揮相應(yīng)的作用。

有研究表明[11]，在MLIF的氨基序列中，Cys-Asn-Ser基團(tuán)是MLIF的藥效基團(tuán)。當(dāng)MLIF(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)的第二個氨基酸Gln(谷氨酰胺)被Pro(脯氨酸)取代后成pMLIF(Met-Pro-Cys-Asn-Ser)時，仍具有抗炎活性；但是把MLIF的氨基酸序列打亂變成sMLIF(Gln-Cys-Met-Ser-Asn)時，抗炎活性消失；而當(dāng)MLIF中的Ser(絲氨酸)被Thr(蘇氨酸)取代后，抗炎活性消失。因此3個氨基酸必須連接在一起時才能發(fā)揮作用。另有研究利用計算機(jī)量子化學(xué)和量子力學(xué)的方法，驗(yàn)證了MLIF發(fā)揮抗炎作用的是Cys-Asn-Ser 基團(tuán)[12]。

2.2　免疫調(diào)節(jié)作用

天然免疫是機(jī)體抵抗和防御病原微生物入侵的第一道防線，也是獲得性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，主要通過吞噬細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮效應(yīng)。免疫是機(jī)體的一種自我保護(hù)形式，在炎癥中，MLIF主要是通過活化、黏附和補(bǔ)充免疫細(xì)胞來參與免疫調(diào)節(jié)，如通過作用于細(xì)胞外基質(zhì)來調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎。

在MLIF改善急性關(guān)節(jié)炎小鼠實(shí)驗(yàn)中[7]，通過分析基因芯片的結(jié)果，按照基因功能，研究人員將參與的基因分為6類：細(xì)胞周期控制基因、凋亡相關(guān)基因、免疫應(yīng)答相關(guān)基因、黏附分子基因、炎癥基因以及其他基因，其中MLIF參與免疫應(yīng)答上調(diào)26條基因，下調(diào)11條基因。在炎癥過程中，MLIF可能是作為一個免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生作用，也可以通過活化、黏附和募集免疫細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

MLIF也可以參與Th1/Th2型免疫應(yīng)答的極化[10]，一方面，在下調(diào)的炎癥趨化因子中，MLIF降低IL-8、MIP-1α和MIP-1β使細(xì)胞向炎癥部位遷移的能力；另一方面，MLIF可以使抗炎因子IL-10過表達(dá)，而IL-10則可以參與Th2型細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制促炎因子如TNF、IL-1β等的合成，從而發(fā)揮抗炎作用。

有研究檢測了MLIF對人CD4+T淋巴細(xì)胞的激活作用和產(chǎn)生胞內(nèi)細(xì)胞因子的影響[13]，結(jié)果表明，MLIF激活了Th1/Th2型的細(xì)胞因子和細(xì)胞因子/受體，有可能是MLIF產(chǎn)生了信號級聯(lián)，從而引起轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的變化，當(dāng)其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核后，與位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)節(jié)更多的細(xì)胞因子。MLIF通過干擾白細(xì)胞遷移，并調(diào)節(jié)抗炎細(xì)胞因子與促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]；也可以抑制細(xì)胞因子如IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生NO，進(jìn)而降低阿米巴原蟲產(chǎn)生的損傷[15]。

2.3　對缺血損傷的保護(hù)作用

缺血性腦血管病是世界上發(fā)病率、死亡率最高的疾病之一，極大地影響了人類的壽命與生活質(zhì)量。MLIF是一種抗炎活性小肽，可以通過血腦屏障，對腦血管病具有良好的預(yù)防與治療作用。Zhang等[16]證實(shí)MLIF通過與核糖體蛋白翻譯延長因子eEF1A1結(jié)合而發(fā)揮作用。其中MLIF與eEF1A1結(jié)構(gòu)域的區(qū)段1(domain1)結(jié)合，抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，升高eNOS的表達(dá)量，改變內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而發(fā)揮保護(hù)作用。不僅如此，MLIF及其部分代謝物還可以顯著地降低小鼠缺血再灌注腦損傷面積，并顯著改善小鼠缺血后的神經(jīng)行為[17，18]，還可以降低心肌缺血模型大鼠的心肌損傷程度和心肌梗塞范圍，防治心肌缺血[19，20]。

此外，Yao等[21]將MLIF的氨基酸基團(tuán)給予修改，設(shè)計并合成出兩個四肽，氨基酸序列分別為Tyr-Cys-Asn-Ser和His-Cys-Asn-Ser，結(jié)果顯示合成的兩個四肽均可以降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，降低炎癥細(xì)胞的黏附和遷移能力，降低血清和腦組織中的MDA含量并升高SOD含量，提示該MLIF類似物在腦缺血再灌注損傷中可以通過抗炎和抗氧化兩條途徑發(fā)揮保護(hù)作用。

2.4　神經(jīng)保護(hù)作用

MLIF不僅保護(hù)缺血損傷，而且參與神經(jīng)保護(hù)。有研究報道[22]MLIF可以改善脊髓挫傷之后的運(yùn)動功能障礙，并且發(fā)現(xiàn)腹角和紅核骨髓神經(jīng)元數(shù)目增加，提示MLIF對神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步探究MLIF增強(qiáng)神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制，研究者檢測了外周血中NO和脂質(zhì)過氧化物的含量，并檢測了iNOS、IL-10、TGF-β基因在損傷區(qū)的表達(dá)。結(jié)果顯示MLIF使體循環(huán)中NO含量和脂質(zhì)過氧化物的水平降低，iNOS基因表達(dá)降低，同時MLIF提高IL-10和TGF-β的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另外，MLIF及其體內(nèi)代謝物能顯著地降低老年性癡呆動物的潛伏時間，增加穿越平臺的次數(shù)，表明MLIF及其體內(nèi)代謝物對血管性癡呆、老年性癡呆及兩者混合癥具有良好的治療作用[23]。

2.5　其他作用

此外，MLIF可以調(diào)節(jié)生長因子、分化因子(如激活素類、抑制素類等)和與其相關(guān)分子的含量，這些分子可以調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)過程，進(jìn)而影響疾病進(jìn)程[24]。MLIF可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的遷移、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、血管增生等生理過程的基因表達(dá)，在機(jī)體修復(fù)過程中扮演重要角色[25，26]。

3展望

MLIF作為一種抗炎活性肽，調(diào)節(jié)著機(jī)體眾多的生理過程，更加全面的報道使得其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的研究得到進(jìn)一步發(fā)展[27]。由于活性肽具有特異性高、活性較強(qiáng)、毒性低、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，加快了活性肽在藥物合成、診斷試劑和疫苗開發(fā)等方面的發(fā)展[28]。隨著研究手段和方法的不斷提高，更多特殊功能的活性肽將會被發(fā)現(xiàn)，其研究將不斷深入，作用機(jī)制將進(jìn)一步得到闡釋，為新藥研發(fā)提供有力的保障。

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