·技術(shù)和方法·

用HPLC法測(cè)定地黃葉中毛蕊花糖苷的含量

王亮1，張巧艷1,年華2，李華強(qiáng)1，3，李云華4，秦路平1*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200437；3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室，上海 200234；4.上海滬豐生物科技有限公司，上海 200433)

[關(guān)鍵詞]毛蕊花糖苷；地黃葉;含量測(cè)定；色譜法, 高效液相

[中圖分類號(hào)]R927.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

DOI：10.5428/pcar20150108

作者簡(jiǎn)介王亮(男),碩士生.E-mail:wangjizuliang@163.com

[收稿日期]2014-01-16

*通信作者(Corresponding author)：秦路平，E-mail:qinsmmu@126.com

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)為玄參科多年生草本植物。其根含有環(huán)烯醚萜苷、氨基酸和糖類等多種化學(xué)成分，具有提高免疫力、增強(qiáng)造血功能、抗腫瘤和抗陰虛等多方面的藥理作用，收載于歷版《中華人民共和國(guó)藥典》中。近年研究發(fā)現(xiàn)，地黃葉含有豐富的毛蕊花糖苷[1]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，毛蕊花糖苷具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[2]，在治療慢性腎臟病[3]、腎毒血清腎炎[4]等方面具有顯著的療效。本研究建立了用HPLC法測(cè)定地黃葉中毛蕊花糖苷的方法，為地黃葉的質(zhì)量研究和資源開發(fā)利用提供參考。

1儀器和試藥

1.1儀器和試劑Agilent 1200系列高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation10.2 工作站(美國(guó)Agilent公司)；BP211D 十萬分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；USC-702超聲波清洗儀(上海波龍電子設(shè)備有限公司)。乙腈(色譜純，批號(hào)20130910)、冰乙酸(色譜純，批號(hào)20130904，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(分析純，批號(hào)20130815，上海斯炯化工科技有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；毛蕊花糖苷(含量>99%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2藥材地黃葉采自河南省焦作市溫縣(批號(hào)為20131001、20131002、20131003)，由上海和凈新能源科技有限公司提供，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室秦路平教授鑒定為玄參科植物地黃 (RehmaniaglutinosaLibosch.) 的葉。

2方法和結(jié)果

2.1溶液的配制(1)對(duì)照品溶液精密稱取干燥至恒重的毛蕊花糖苷對(duì)照品2.17 mg，置5 ml量瓶中，用甲醇溶解, 稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.434 mg/ml的對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液 取新鮮藥材剪成約為0.5 cm小塊，

50 ℃

減壓干燥20 h，粉碎成粗粉，精確取樣品0.8 g，置100 ml帶塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲提取30 min，靜置5 min后再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置5 min，過濾，收集提取液。同法用50 ml甲醇重復(fù)提取2次。合并提取液，搖勻，靜置5 min后，精密量取10 ml溶液，減壓濃縮至近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相乙腈-0.1%乙酸溶液(16∶84)[5]溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2色譜條件Agilent 1200 系列高效液相色譜儀；Eclipse-XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相見2.1(2)項(xiàng)；流速 1.0 ml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；進(jìn)樣量：20 μl。地黃葉的HPLC譜圖見圖1。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取2.1(1)項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、4、8、12、16、20 μl，記錄色譜圖和峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)毛蕊花糖苷的量(X)作線性回歸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得毛蕊花糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=822 182X+13.2，r=0.999 9，線性范圍為0.434～8.68 μg。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)供試品溶液(批號(hào)20131001)，分別于0、2、4、8、10、12 h，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積RSD為1.56%(n=3)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20131001)，按2.1(2)項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算毛蕊花糖苷峰面積RSD為1.08%(n=3)，表明方法重復(fù)性良好。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)取2.1(1)項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積RSD為1.53%(n=3)，表明儀器精密度良好。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批(批號(hào)20131001)已知含量的地黃樣品6份，加入一定量的毛蕊花糖苷對(duì)照品，按照2.1(2)項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定毛蕊花糖苷的含量，計(jì)算回收率及其RSD值，結(jié)果毛蕊花糖苷的平均回收率為98.05%，RSD為4.40% (n=6)，具體見表1。

2.8樣品含量測(cè)定取地黃藥材，按2.1(2)項(xiàng)下方法制備3批供試品溶液， 按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 計(jì)算含量。 結(jié)果批號(hào)為20131001、 20131002、 20131003 的地黃葉樣品中毛蕊花糖苷的含量分別為(25.83±0.34)、(25.08±0.43)、(25.57±0.05) mg/g生藥，平均含量為(25.49±0.38) mg/g(n=3)。

3討論

本研究建立了地黃葉中毛蕊花糖苷的HPLC含量測(cè)定方法。研究中，作者比較了藥材干燥方式和提取方法對(duì)毛蕊花糖苷含量的影響。在80 ℃溫度下，干燥24 h，地黃葉中毛蕊花糖苷的含量降低20%左右，表明溫度和干燥時(shí)間影響地黃葉中毛蕊花糖苷的含量。在提取方法上，作者比較了加熱回流和超聲提取對(duì)地黃葉中毛蕊花糖苷含量的影響，加熱回流提取地黃葉中毛蕊花糖苷的含量降低30%左右。超聲提取所需時(shí)間短，提取率高，一次提取其轉(zhuǎn)移率即可達(dá)80%以上，最終確定超聲處理3次提取地黃葉中的毛蕊花糖苷。

有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用甲醇-冰乙酸-水作為流動(dòng)相可對(duì)地黃葉中的毛蕊花糖苷進(jìn)行良好的分離[6]。作者比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸等流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%乙酸有較好的分離效果，所以最終選擇乙腈-0.1%乙酸為流動(dòng)相。本研究所建立的HPLC法可以使毛蕊花糖苷與藥材中的其他成分達(dá)到基線分離，分析時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

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[修回日期]2014-12-22

[本文編輯]陽凌燕