·論著·

異甘草酸鎂對成纖維細胞NF-κB信號通路活性的影響

徐建國1，劉繼勇2，胡晉紅2*

(1.第二軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部病理生理學教研室，上海 200433；2. 第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433)

[摘要]目的：研究異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)對成纖維細胞核因子-kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路活性的影響。方法：實驗分6組，為空白對照組、TNF-α模型組、地塞米松(dexamethasone，DEX)陽性對照組和0.1、1、10 mg/ml的MgIG組。DEX組和MgIG組分別給予DEX(1 μg/ml)和MgIG(0.1、1、10 mg/ml)預處理4 h后，除對照組外，其余5組加入TNF-α(20 ng/ml)作用1.5 h。提取細胞核蛋白，以免疫印跡法檢測NF-κB p65蛋白質(zhì)表達。提取總RNA，用實時PCR技術檢測細胞內(nèi)IκBα mRNA表達。成纖維細胞經(jīng)DEX和MgIG預處理4 h后加入TNF-α作用24 h(濃度同上)，用報告基因技術檢測NF-κB基因表達。結(jié)果：成纖維細胞經(jīng)TNF-α作用1.5 h后，細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白質(zhì)表達量明顯增加，IκBα mRNA表達上調(diào)；TNF-α作用24 h后，NF-κB基因上調(diào)。DEX預處理4 h，可以明顯減少TNF-α引起的核內(nèi)NF-κB p65蛋白質(zhì)表達和細胞內(nèi)IκBα mRNA表達，明顯降低與TNF-α共作用24 h后NF-κB基因表達。MgIG處理成纖維細胞4 h后，能夠明顯降低TNF-α作用1.5 h后核內(nèi)NF-κB p65蛋白質(zhì)表達量，但對IκBα mRNA表達水平無明顯影響。1、10 mg/ml的MgIG能夠明顯降低與TNF-α共作用24 h后NF-κB基因表達水平。結(jié)論：MgIG的抗炎作用與抑制NF-κB p65轉(zhuǎn)位入核和NF-κB基因表達，從而抑制NF-κB信號通路活性相關，但與DEX不同的是MgIG不能改變IκBαmRNA表達水平。

[關鍵詞]異甘草酸鎂；NF-κB信號通路；抗炎作用

[中圖分類號]R285.5，R966，R967[文獻標志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150107

基金項目國家自然科學基金(81373896)

作者簡介徐建國(男)，博士.E-mail：chxdejia@hotmail.com

[收稿日期]2014-01-10

Effect of magnesium isoglycyrrhizinate on NF-κB signaling pathway activity in fibroblasts

XU JianGuo1，LIU JiYong2，HU JinHong2*(1. Department of Pathophysiology，F(xiàn)aculty of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2. Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective: To investigate the effect of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the activity of nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway in fibroblast cells (FCs). Methods: The experiment consisted of 6 groups: the blank control group, the TNF-α model group, the dexamethasone (DEX) positive control group, and the 3 different concentrations of MgIG groups (i.e. 0.1,1 and 10 mg/ml subgroups). The DEX group and the MgIG groups were pretreated respectively with DEX (1 μg/ml ) and MgIG (0.1, 1 and 10 mg/ml) for 4 h. Then, with the exception of the control group, all the other 5 groups were treated with TNF-α(20 ng/ml) for 1.5 h. Nuclear proteins and total RNA were collected for detecting the expression levels of NF-κB p65 protein by Western blot. Total RNA was collected and used for detecting the expression levels of IκBα mRNA by real-time PCR. Following pretreatment with DEX and MgIG for 4 h, the FCs were treated with TNF-α(with the same dosage as the above) for 24 h, and then the expression levels of NF-κB were detected by reporter gene technology. Results: Following treatment with TNF-α for 1.5 h, the expression levels of intranuclear NF-κB p65 and intracellular IκBα mRNA in FCs were obviously increased, and 24-h treatment with TNF-α also increased the expression levels of NF-κB. Pretreatment with DEX for 4 h could decrease the expression levels of intranuclear NF-κB p65 and intracellular IκBα mRNA gene induced by TNF-α, and could also significantly reduce the expression levels of NF-κB following combined treatment with TNF-α for 24 h. Treatment of FCs with MgIG for 4 h could significantly lower the expression levels of intranuclear NF-κB p65 after pretreatment with TNF-α for 1.5 h. However, no significant effects could be noted on the expression levels of IκBα mRNA. MgIG with dosages of 1.0 and 10 mg/ml could significantly decrease expression levels of NF-κB following combined treatment with TNF-α for 24 h.Conclusion: The anti-inflammatory effect of MgIG was related with the inhibited NF-κB p65 nuclear transposition and NF-κB gene expression, and was also associated with the inhibited activity of NF-κB signaling pathway. When compared with DEX, MgIG failed to exert significant effect on the expression of IκBα mRNA.

[KEY WORDS]magnesium isoglycyrrhizinate; NF-κB signaling pathway; anti-inflammatory effect

[Pharm Care Res，2015，15(1): 22-26]

*通信作者(Corresponding author)：胡晉紅，E-mail: hjhong2016@126.com

異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)屬于18α-甘草酸中藥單體制劑，與具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保肝活性的異甘草素[1]同屬于18α-甘草酸，于2005年開始應用于慢性肝炎的治療，具有明顯的護肝和抑制肝炎發(fā)展的作用，對接觸性皮炎小鼠MgIG可明顯減輕炎癥反應[2]，但其具體抗炎機制不詳。本研究通過檢測MgIG對成纖維細胞(fibroblast cells,FCs) NF-κB p65蛋白質(zhì)表達的啟動子變化情況，以及IκBα mRNA水平變化情況，研究MgIG是否通過改變NF-κB信號通路活性而發(fā)揮抗炎作用。

1材料和方法

1.1試劑和儀器異甘草酸鎂(粉劑，批號：081003，江蘇省正大天晴藥業(yè)股份有限公司提供)；TNF-α(美國PeproTech公司)；地塞米松(DEX)(粉劑，美國Sigma公司)；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；PrimeScriptTM RT-PCR Κit(日本Takara公司)；兔多克隆NF-κB p65抗體、小鼠單克隆TATA框結(jié)合蛋白(TATA box binding protein，TBP)抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術研究所)；Micro BCA Protein Assay Kit、Supersignal West Femto 顯影試劑盒(美國Pierce 公司)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技術有限公司)；核蛋白抽提試劑盒(上?？党缮锕こ逃邢薰?；QIAGEN Plasmid Midi Κits(德國Qiagen公司)；pGL3-NF-κB-luc質(zhì)粒和pRL-TΚ-Renilla-luc質(zhì)粒均由第二軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部病理生理學教研室合成；常見細胞系轉(zhuǎn)染試劑(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；IκBα基因及內(nèi)參還原磷甘油醛脫氫酶(GAPDH)的正向、反向引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)純化。IκBα 正向引物：5′-CTGAAGGCTACCAACTACAATG-3′，反向引物：5′-CATCAGCACCCAAGGACAC-3；GAPDH正向引物：5′-TGAAGGTCGGTGAACGGATTTGGC-3′，反向引物：5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。Dual-Luciferase Reporter Assay System、Turner DesignsTD-20/20熒光檢測儀(美國 Promega公司)；PROTEAN II XL 多板電泳槽(美國Bio-Rad公司)；ABI 7300 Real-Time定量PCR儀(美國ABI公司)；紫外分光光度計(上海光學儀器五廠有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1FCs的分離及培養(yǎng)參照朱全剛等[3]建立的方法：取包皮環(huán)切術健康人包皮(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院整形外科提供)，置0.05%的醋酸洗必泰滅菌溶液中反復洗滌2次(約5 min)， PBS漂洗3次。在無菌條件下剪去皮下組織，將含表皮及真皮的皮膚組織剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的皮塊，置于0.2%的分散酶液中，4 ℃消化過夜。次日用無菌鑷子揭下已同真皮分離的表皮，剩下的真皮以無菌組織剪充分剪碎，置0.2% Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃ 消化1 h，吹打制備細胞懸液，200目消毒尼龍篩過濾。200×g離心10 min，棄上清液。加含20%胎牛血清(FBS)及青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，以105個細胞/瓶接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液一次。待細胞接近融合后傳代擴大培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶溶液消化進行傳代，取第7～10代細胞用于實驗。

1.2.2分組和給藥FCs傳代于培養(yǎng)瓶，以10%血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至70%～80%融合后，換以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，靜息24 h后用于實驗。實驗分成6組，分別為空白對照組、TNF-α模型組、DEX陽性對照組和0.1、1、10 mg/ml的MgIG組。DEX組和MgIG組分別加入DEX(終濃度1 μg/ml)和MgIG(終濃度分別為0.1、1、10 mg/ml)預處理4 h，然后除對照組外，其余5組FCs均加入TNF-α(終濃度20 ng/ml)再培養(yǎng)1.5 h(TNF-α、DEX及MgIG均以無血清培養(yǎng)基溶解稀釋)。經(jīng)藥物處理后的6組細胞用于NF-κB p65蛋白質(zhì)和IκBα mRNA表達水平的測定。

1.2.3核內(nèi)NF-κB p65蛋白質(zhì)測定分別收集6組細胞于試管中，按照核蛋白抽提試劑盒說明書提取各組細胞內(nèi)核蛋白，通過BCA法進行蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)稀釋至相同濃度后，以8%的SDS-PAGE法分離蛋白質(zhì)，采用Bio-Rad濕式電轉(zhuǎn)移裝置15 V，15 min；85 V，90 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，依據(jù)Marker對應的65 κD條帶和內(nèi)參TBP的38 κD條帶，將PVDF膜剪成合適大小，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入NF-κB p65抗體、TBP抗體4 ℃過夜，隨后TBST洗膜后，加入辣根酶標記馬抗山羊IgG(1∶1000)，室溫反應10 min。掃描并通過Image J進行灰度分析，NF-κB p65蛋白質(zhì)含量以NF-κB p65條帶和內(nèi)參TBP條帶的灰度比值表示。

1.2.4IκBα mRNA表達水平的檢測按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書，抽提25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的各組細胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度計和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行RNA純度和含量測定。參照PrimeScriptTM RT-PCR Κit說明書，進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA備用。采用20 μl反應體系進行實時PCR：cDNA template 2 μl，正向引物、反向引物各0.4 μl，DEPC水7.2 μl，SYBR Green 10 μl。實時PCR反應條件：采用2復孔進行反應，預變性：95 ℃ 10 s；變性+延伸：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；解離：65 ℃ 15 s。用實時定量PCR儀分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用IκBα mRNA和內(nèi)參(GAPDH)相對表達量表示。

1.2.5報告基因檢測技術檢測NF-κB基因表達另取FCs傳代于24孔板，以10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至70%～80%融合后，換以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，靜息24 h后，按照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑說明書，各培養(yǎng)孔內(nèi)加入pGL3-NF-κB-luc質(zhì)粒(為含有NF-κB啟動子鏈接螢火蟲蛋白基因的質(zhì)粒)1 μg、 pRL-TΚ-Renilla-luc質(zhì)粒(為含表達穩(wěn)定的結(jié)構基因鏈接海腎素熒光蛋白基因的參照質(zhì)粒)10 ng和SunbioTM Trans-EZ常見細胞系轉(zhuǎn)染試劑1 μl，培養(yǎng)8 h后換以無血清DMEM培養(yǎng)基，靜息培養(yǎng)24 h。依據(jù)1.2.2分組，DEX組和3個濃度MgIG組分別用相應藥物預處理4 h，然后除對照組外，其余5組FCs均加入TNF-α再靜息培養(yǎng)24 h。按照promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑說明書進行熒光檢測[4]，分別記錄560 nm處螢火蟲熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)和460 nm處海腎素FI，結(jié)果用FI560/FI460比值表示，為NF-κB基因相對表達水平。

2結(jié)果

2.1MgIG對TNF-α處理后細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白質(zhì)含量的影響實驗結(jié)果如圖1所示，TNF-α刺激真皮成纖維細胞1.5 h后，細胞核內(nèi)NF-κB p65含量明顯增多，表明NF-κB信號通路被激活。與單純TNF-α(模型)組比較，DEX組細胞核內(nèi)NF-κB p65含量明顯降低(P<0.01)，而MgIG同樣能夠明顯降低核內(nèi)NF-κB p65的含量(P<0.05)，但降低程度小于DEX組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明MgIG能夠抑制NF-κB p65信號通路的激活，但抑制作用明顯弱于DEX。

圖1　異甘草酸鎂對TNF-α引起成纖維 細胞NF-κB p65表達的影響 Figure 1　Effect of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the expression of NF-κB p65 in fibroblast cells induced by TNF-α 模型組：TNF-α 20 ng/ml；DEX組：DEX 1 μg/ml+TNF-α 20 ng/ml；高濃度MgIG組：MgIG 10 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml；中濃度MgIG組：MgIG 1 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml；低濃度MgIG組：MgIG 0.1 mg/ml+TNF-α 20 ng/ml; **P<0.01，與對照組比較； △P<0.05， △△P<0.01，與模型 組比較； ▲P<0.05，與DEX組比較；n=3， ±s

2.2MgIG對IκBα mRNA表達的影響如圖2所示，與對照組比較，模型組的IκBα mRNA水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，DEX組IκBα mRNA水平略有上調(diào)，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同濃度MgIG作用后，僅低濃度組的IκBα mRNA的表達有明顯改變(P<0.05)。

2.3MgIG對TNF-α引起成纖維細胞NF-κB基因表達的影響雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果如圖2所示。與對照組比較，模型組在TNF-α刺激24 h后，F(xiàn)Cs內(nèi)NF-κB基因表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)，DEX能夠抑制TNF-α引起的NF-κB基因水平升高，而中、高濃度(1、10 mg/ml)的MgIG作用后也能明顯降低NF-κB基因表達水平(P<0.05)，但這種作用明顯弱于DEX組(P<0.05)。

3討論

甘草是一種傳統(tǒng)中藥，主要含有三萜類化合物(包括甘草次酸和甘草酸)和黃酮類化合物(包括甘草苷、異甘草素、異甘草酸苷和香豆素)[5]。臨床使用其提取物應用于解毒劑、止痛劑、祛痰劑、止咳藥、抗氧化劑和抗炎治療的輔助用藥。甘草甜素(甘草酸)是自甘草中提取的三萜類有效成分，臨床顯示其在治療肝炎中有重要作用，同時在多種細胞中的實驗表明，甘草酸具有抗氧化，減少caspase-3表達并降低其活性，減少細胞凋亡，抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6等炎性細胞因子的表達，且其抗炎作用與促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號系統(tǒng)密切相關[6]。作為其同分異構體的異甘草素對炎癥的抑制同樣發(fā)揮重要作用，在結(jié)腸炎相關的腫瘤發(fā)生研究中，發(fā)現(xiàn)其通過下調(diào)PGE2和IL-6信號通路而抑制M2巨噬細胞極化作用[7],但異甘草素對NF-κB信號通路的影響尚不確定。而甘草的另一個黃酮類化合物甘草查爾酮A通過抑制NF-κB p65中絲氨酸的磷酸化，顯著抑制LPS信號通路發(fā)揮抗炎作用[8]。在作者的研究中發(fā)現(xiàn)MgIG發(fā)揮抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路活性起作用的。

圖2　異甘草酸鎂對TNF-α引起成纖維細胞IκBα mRNA和NF-κB基因表達的影響 Figure 2　The effects of magnesium isoglycyrrhizinate (MgIG) on the expressions of IκBα mRNA and NF-κB gene in fibroblast cells induced by TNF-α

NF-κB信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)免疫反應、炎癥反應、細胞分化和凋亡，以及腫瘤形成等多種生物學功能。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子通常與其抑制物IκBα結(jié)合形成復合物，并在胞漿與胞核間達到平衡，信號通路激活后短時間內(nèi)復合物解聚，大量活性NF-κB迅速轉(zhuǎn)移入核，與相應靶基因位點結(jié)合促進其表達。TNF-α是通路激活的主要介導因子，Shin等[9]證實甘草的另一個重要抗炎成分甘草醇通過抑制RAW264.7巨噬細胞的IκBα磷酸化，減少NF-κB p65轉(zhuǎn)移入核，從而發(fā)揮抑制NF-κB信號通路活性的作用。在作者的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α作用于FCs 1.5 h后能夠明顯提高核內(nèi)NF-κB p65含量，而經(jīng)MgIG預處理4 h的FCs，這種激活NF-κB p65轉(zhuǎn)位入核的作用被明顯減弱。MgIG對TNF-α引起的IκBα mRNA表達水平升高無明顯影響，而DEX在與TNF-α聯(lián)合作用后進一步增加了IκBα mRNA表達，說明IκBα可能沒有參與TNF-α刺激作用下MgIG的抗炎作用過程。在NF-κB信號通路中，IκBα表達的增多能夠抑制信號通路活性，TNF-α作用在激活NF-κB信號通路后可能負反饋引起了IκBα mRNA表達的增多，DEX在發(fā)揮廣泛的抗炎過程中可能通過其他途徑增加了IκBα mRNA的表達。另外此實驗結(jié)果表明，MgIG對IκBα mRNA表達的影響不同于甘草醇[9]，可能與Shin等使用的是LPS刺激模型有關。在TNF-α作用24 h后，F(xiàn)Cs內(nèi)NF-κB基因表達水平升高明顯，而一定濃度的MgIG能夠抑制其表達，這與Shin等的研究結(jié)果一致。近幾年發(fā)現(xiàn)甘草次酸對惡性腫瘤有明顯的抑制作用，18β-甘草次酸能夠通過PI3K/Akt依賴的NF-κB信號通路的活性，下調(diào)MMP-9和VEGF的表達，從而改變腫瘤細胞侵襲能力等生物學活性[10]。甘草制劑這種對NF-κB信號通路活性的抑制作用在作者研究18α-甘草酸MgIG對FCs的影響中也得到證實。

【參考文獻】

[1]Kim Y M，Kim T H，Kim Y W，etal. Inhibition of liver X receptor-α-dependent hepatic steatosis by isoliquiritigenin, a licorice antioxidant flavonoid, as mediated by JNK1 inhibition[J]. Free Radic Biol Med，2010，49(11)：1722-1734.

[2]徐建國，劉繼勇，彭程，等. 異甘草酸鎂抗小鼠接觸性過敏性皮炎的藥效學研究[J].中國中藥雜志，2010，35(10)：1311-1314.

Xu JianGuo，Liu JiYong，Peng Cheng，etal. Effect of magnesium isoglycyrrhizinate on allergic contact dermatitis (ACD) in mice[J].China J Chin Mater Med, 2010，35(10)：1311-1314. In Chinese with English abstract.

[3]朱全剛，胡晉紅，范國榮，等. 酮洛芬異丙酯在皮膚細胞中的代謝[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2002,22(4):195-197.

Zhu QuanGang，Hu JinHong，F(xiàn)an GuoRong,etal. Metabolism of ketoprofen isopropyl ester in skin cells[J]. Chin Hosp Pharm J， 2002，22(4)：195-197. In Chinese with English abstract.

[4]俞石芳，李強，洪俊英，等. 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證has-miR-326對BCL2L1、BAK1的靶向調(diào)控[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2014,24(8):1156-1158.

Yu ShiFang，Li Qiang，Hong JunYing,etal. The targeted-regulating role of hsa-miR-326 on geneBCL2L1 andBAK1 by dual luciferase reporter system[J]. Chin J Health Lab Technol，2014，24(8)：1156-1158. In Chinese with English abstract.

[5]Dong Yi，Zhao MouMing，Zhao TianTian，etal. Bioactive profiles, antioxidant activities, nitrite scavenging capacities and protective effects on H2O2-injured PC12 cells ofGlycyrrhizaglabraL. leaf and root extracts[J]. Molecules, 2014, 19(7): 9101-9113.

[6]Ye ShaoJun，Zhu Yi，Ming YingZi，etal. Glycyrrhizin protects mice against renal ischemia-reperfusion injury through inhibition of apoptosis and inflammation by downregulating p38 mitogen-activated protein kinase signaling[J]. Exp Ther Med, 2014，7(5)：1247-1252.

[7]Zhao HaiXia，Zhang XinHua，Chen XueWei，etal. Isoliquiritigenin, a flavonoid from licorice, blocks M2 macrophage polarization in colitis-associated tumorigenesis through downregulating PGE2and IL-6[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2014, 279(3)：311-321.

[8]Furusawa J，F(xiàn)unakoshi-Tago M，Tago K，etal. Licochalcone A significantly suppresses LPS signaling pathway through the inhibition of NF-κB p65 phosphorylation at serine 276[J]. Cell Signal，2009，21(5)：778-785.

[9]Shin E M，Zhou HongYu，Guo LianYu,etal. Anti-inflammatory effects of glycyrol isolated fromGlycyrrhizauralensisin LPS-stimulated RAW264.7 macrophages[J]. Int Immunopharmacol，2008，8(11)：1524-1532.

[10]Jayasooriya R G P T，Dilshara M G，Park S R，etal. 18β-Glycyrrhetinic acid suppresses TNF-α induced matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor by suppressing the Akt-dependent NF-κB pathway[J]. Toxicol In Vitro，2014，28(5)：751-758.

[修回日期]2014-11-27

[本文編輯]貢沁燕