張炳麗 康 真 梁 爽 李 然 宋曉琳 范榮軍

哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150056

10種常見水果果汁體外抗EV71病毒研究

張炳麗 康 真 梁 爽 李 然 宋曉琳 范榮軍▲

哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150056

目的 觀察10種常見水果果汁對手足口EV71病毒所引起細胞病變（CPE）的抑制作用。 方法 采用MTT比色法，測定10種常見水果果汁對Hep Ⅱ細胞的細胞毒性，并在對細胞的最大無毒濃度（MNCC）范圍內(nèi)，采用體外細胞培養(yǎng)法研究10種常見水果果汁對手足口EV71病毒病毒的抑制作用。在此基礎(chǔ)上計算出蘋果汁和葡萄汁對EV71病毒的半數(shù)抑制濃度的IC50值。 結(jié)果 在10種常見水果果汁中篩選出蘋果汁和葡萄汁兩種具有抗手足口EV71病毒作用的果汁，其IC50值分別為果汁原液的1.652倍稀釋液和9.965倍稀釋液。 結(jié)論 蘋果汁和葡萄汁具有進一步篩選抗EV71病毒有效成分的研究價值。

果汁；EV71；抗病毒；體外；篩選

手足口?。℉FMD）發(fā)病者主要是5歲以下嬰幼兒，是一種由小RNA病毒引起的腸道傳染性疾病，嚴(yán)重威脅嬰幼兒健康，已成為西太平洋地區(qū)的重大公共問題之一[1]。EV71型或柯薩奇病毒A16組病毒作為病原可引起少數(shù)患兒發(fā)生免疫、神經(jīng)和（或）循環(huán)系統(tǒng)等功能能紊亂而導(dǎo)致臨床重癥或死亡而關(guān)注度較高[2]，近年來引起的HFMD暴發(fā)流行越來越頻繁，EV71引起的重癥HFMD患者比例及病死率均明顯高于其他腸道病毒[3]。

古有“神農(nóng)嘗百草”之舉、“藥食同源”之說，表述了食物可達到預(yù)防、輔助治療疾病的目的[4]?！八幨惩础钡臍v史源遠流長，早在周代《周禮·天官》中記載了疾醫(yī)主張“五味、五谷、五藥養(yǎng)其病”；春秋戰(zhàn)國時期《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載，“谷肉果，食養(yǎng)盡之，無使過之，傷其正也”。隨后，“食治”“食養(yǎng)”“寓醫(yī)于食”等概念相繼被人們提出強調(diào)了藥食同源植物在保健、預(yù)防和輔助治療疾病等方面的作用[5]。

因?qū)和故乘幬锎嬖谝恍├щy，并且藥物對兒童的許多毒副作用都不詳，EV71型手足口病又以5歲以下兒童為主，因此我們希望篩出對EV71病毒有抑制作用的兒童較易接受的果汁，來實現(xiàn)對手足口EV71病毒的治療或預(yù)防作用。

1　儀器與試劑

1.1儀器

核酸提取儀（德國 QIAGEN公司，QIAcube 型），熒光定量 PCR 儀（美國 ABI 公司，7500 型），榨汁機（中國九陽，JYZ-B550型），超純水儀（美國Millipore公司，Milli-Q型），CO2培養(yǎng)箱（日本 SANYO 公司，MCO-15A 型），酶標(biāo)儀（美國 BIO-RAD 公司，MODEL680 型），倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司，TE2000-5 型） 。

1.2水果

各種水果均購自于哈爾濱市農(nóng)貿(mào)市場。

2　細胞和病毒

2.1實驗細胞株

Hep Ⅱ細胞：人喉癌上皮細胞（本實驗室傳代細胞）。

表1　10種果汁各稀釋度4天時對Hep Ⅱ細胞的毒性情況

2.2實驗病毒株

EV71病毒：選擇本實驗室2013年采集置-70℃保存的咽拭子，經(jīng)本實驗室增毒后經(jīng)real-time PCR方法檢測，PE和EV71均為陽性，CA16為陰性樣本。

3　方法

3.1果汁的制備

加果汁當(dāng)日將購買的新鮮水果用清水沖洗干凈后晾干保存，用榨汁機進行榨汁，新鮮果汁用超純水稀釋，過0.2μm濾膜過濾除菌置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

3.2病毒增殖和病毒感染性的測定[6-8]

具體操作與參考文獻[8]病毒增殖和病毒感染性的測定方法相同。

3.3果汁細胞毒性檢測

將果汁用超純水1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25稀釋，接種于準(zhǔn)備好的細胞上，每個稀釋度設(shè)4孔，同時設(shè)不加果汁的正常細胞對照培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，連續(xù)4d 觀察果汁毒性，細胞出現(xiàn)病變者判為果汁毒性，并根據(jù)公式計算果汁對Hep Ⅱ細胞的毒性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果在計算機中經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，細胞病變達10%以上判定為有細胞毒性。

3.4果汁對EV71病毒的作用[8-9]

具體操作見參考文獻[8]利巴韋林對EV71病毒的作用部分。加樣量為每孔加100μL起始稀釋倍數(shù)為最小無毒性稀釋倍數(shù)的果汁，并對倍稀釋，連續(xù)8個稀釋度，每個稀釋度設(shè)4孔。酶標(biāo)儀上490nm處測定OD值[9]。并根據(jù)公式計算利巴韋林注射液對EV71病毒的抑制率。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果在計算機中經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。

病毒抑制率=（試驗組平均OD值-病毒對照組平均OD值）/（細胞對照組平均OD值-病毒對照組平均OD值）×100%。

4　結(jié)果

4.1EV71病毒感染性的測定

根據(jù)在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞病變，Reed-Muench 法計算TCID50。TCID50= Antilog [CPE＞50%病毒稀釋度+（＞50%的百分?jǐn)?shù)-50%）/（＞50%的百分?jǐn)?shù)-＜50%的百分?jǐn)?shù)）×lg10]計算結(jié)果本次實驗的所得到的EV71病毒液的TCID50為：2.43×10-6/0.1mL。

4.2果汁細胞毒性檢測結(jié)果

各種果汁各稀釋度對Hep Ⅱ細胞的毒性情況如表1所示。

表2　10種果汁抗EV71病毒活性結(jié)果

由表1我們可以看出，西瓜汁、柚子汁、桃汁、蘋果汁和梨汁在1∶5最低稀釋度時對Hep Ⅱ細胞均無毒性作用，因此，將1∶5稀釋度作為這五種水果的起始稀釋倍數(shù)；葡萄汁、桔子汁和水果番茄汁這三種果汁在1∶10稀釋度時對Hep Ⅱ細胞無毒性作用，因此，將1∶10稀釋度作為這三種水果的起始稀釋倍數(shù)；而菠蘿汁和獼猴桃汁在1∶15稀釋度時對Hep Ⅱ細胞無毒性作用，這兩種果汁的起始稀釋倍數(shù)設(shè)定為1∶15。

4.3果汁抗EV71病毒活性篩選

CPE觀察法和MTT分析法檢測果汁抗EV71病毒的抑制效率見表2。從表2數(shù)據(jù)我們可以看出，蘋果汁和葡萄汁對EV71病毒有抑制作用。根據(jù)表2相關(guān)數(shù)據(jù)繪制蘋果汁和葡萄汁對EV71病毒的抑制作用曲線，根據(jù)曲線擬合出的公式計算果汁對EV71病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。把果汁稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以果汁的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率時候的果汁稀釋倍數(shù)，就是IC50。

圖1　蘋果汁對EV71病毒抑制曲線

圖2　葡萄汁對EV71病毒抑制曲線

由圖1和圖2公式計算，蘋果汁對EV71病毒的半數(shù)抑制濃度的IC50計算值為0.3304倍稀釋，因蘋果汁1倍稀釋時實際為原液的1∶5稀釋，因此蘋果汁的IC50值實際為原液的1.652倍稀釋；葡萄汁對EV71病毒的半數(shù)抑制濃度的IC50計算值為0.9965倍稀釋，因葡萄汁1倍稀釋時實際為原液的1∶10稀釋，因此蘋果汁的IC50值實際為原液的9.965倍稀釋。

5　討論

EV71所致HFMD全年均可發(fā)病，無地域性限制，以5～7月為高峰季節(jié)，平均3～5d，潛伏期2～10d。EV71已被公認為是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒被消滅以后最重要的嗜神經(jīng)性腸道病毒[10]?；颊?、隱性感染及健康帶毒者均可成為傳染源；可經(jīng)呼吸道、消化道及直接接觸等多途徑傳播，故常引起聚集甚至難以控制的流行[6]。EV71病毒感染已經(jīng)成為我國重要的公共衛(wèi)生問題[11-12]，因此，尋找對EV71具有治療或預(yù)防作用的物質(zhì)具有重要意義[13-14]。

蘋果和葡萄均是物美價廉的普通水果，市場供應(yīng)很豐富。蘋果汁是一種廉價的改善身體健康的飲品，蘋果汁可以預(yù)防心臟病[15]，喝蘋果汁也可清潔肝、腎，減少肝臟或腎臟疾病。葡萄汁被科學(xué)家們譽為“植物奶”[16]。食品專家卡邁勒教授說，葡萄因含有許多對身體有益的物質(zhì)而在醫(yī)療方面具有重要意義。因此，這兩種物質(zhì)用來預(yù)防EV71病毒感染是十分可行的。

蘋果汁和葡萄汁抑制率曲線顯示，果汁在低濃度（高稀釋倍數(shù)）時抑制率受濃度影響較大，但在高濃度（低稀釋倍數(shù)）時抑制率受濃度影響較小，相對平緩趨于一條直線。該曲線在實驗的濃度范圍內(nèi)擬合成一條對數(shù)曲線，但在實際中該曲線的X軸取值具有一定的范圍，抑制率不可能無限增大。因我們使用的榨汁機不能完全獲得水果的全部果汁，因此果汁獲得率和相應(yīng)的質(zhì)量換算無法進行，我們只能用稀釋倍數(shù)來表示。

本研究遺憾的是我們沒有分析出蘋果汁與葡萄汁中抵抗EV71病毒的成分，我們懷疑是維生素C，但使用黑龍江省藥品檢驗所提供的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品開展實驗，結(jié)果顯示其沒有抑制EV71病毒感染的功效。這需要我們在今后的工作中繼續(xù)探索。

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A study on anti-EV71 virus in vitro of 10 kinds of common fruit juice

ZHANG Bingli KANG Zhen LIANG Shuang LI Ran SONG Xiaolin FAN Rongjun
Harbin Center for Disease Control and Prevention, Harbin 150056, China

Objective To observe the inhibitory effect of 10 kinds of common fruit juice on cytopathic effect (CPE) caused by hand, foot and mouth EV71 virus. Methods The cytotoxicity of 10 kinds of common juice to Hep Ⅱ was determined by MTT assay. The inhibitory effect of 10 kinds of common juice on hand, foot and mouth EV71 virus was studied by cell culture in vitro within the maximum non-toxic concentration of cells (MNCC). Then inhibitory concentration 50 (IC50) values of apple juice and grape juice for EV71 virus were calculated. Results Apple juice and grape juice with the function of anti-hand， foot and mouth EV71 virus were selected from 10 kinds of common juice. The IC50values were respectively 1.652 times dilution and 9.965 times dilution of the original fruit juice. Conclusion Apple juice and grape juice have a research value of further selecting effective components of anti-EV71 virus.

Fruit juice; EV71; Anti-virus; In vitro; Select

R285.5

A

2095-0616（2015）10-13-04

黑龍江省普通高等學(xué)校營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)重點實驗室開放課題資助項目（YYKFKT1203）。

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（2015-02-27）