王麗麗，朱葆華，楊官品，潘克厚**

（中國海洋大學(xué)1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003）

植物細(xì)胞合成脂肪酸時(shí)，乙酰CoA羧化酶將乙酰CoA轉(zhuǎn)變?yōu)楸釂熙oA［1］，再經(jīng)過脂肪酸合酶的催化，每循環(huán)增加2個(gè)碳延伸?；兼湥?］，最后硫酯酶（Thioesterase，TE）分解出脂肪酸和ACP，完成脂肪酸合成［3］。根據(jù)底物特異性，植物硫脂酶分為2類，F(xiàn)atA和 FatB［4－5］。FatA傾向水解不飽和酰基-ACP，對(duì)C18∶1-ACP有很強(qiáng)活性，而FatB傾向水解飽和或較短的?；?ACP［6－10］。細(xì)菌硫脂酶則分為硫脂酶I和硫脂酶II，它們可以水解?；?CoA和?；?ACP，其中硫脂酶I催化C12-C18?；?ACP/CoA水解，而硫脂酶II催化C6-C18酰基-ACP/CoA 水解［11］。目前，多種植物包括加州月桂、澳洲堅(jiān)果、萼距花、擬南芥等的硫脂酶基因已被克隆并驗(yàn)證了功能［2，7，12－13］。然而，藻類硫脂酶基因的克隆和功能驗(yàn)證卻鮮有報(bào)道。

微擬球藻（Nannochloropsisoceanica）屬于真眼點(diǎn)藻綱（Eustigmatophyceae），多數(shù)分布于海洋，淡水中也有分布［14－15］，富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、色素等高附加值產(chǎn)物［16－18］，是一類重要的單細(xì)胞經(jīng)濟(jì)微藻。近年來，微擬球藻更是有望用于生產(chǎn)生物柴油［17－18］。脂質(zhì)積累必須經(jīng)過脂肪酸合成、去飽和、延伸、?；炔襟E。微擬球藻含有豐富的油脂，因此，其必含有一套完整且高效的脂肪酸合成酶系。硫脂酶是脂肪酸合成通路的關(guān)鍵酶，水解?；?ACP，釋放脂肪酸［10，19］。目前，關(guān)于微擬球藻脂肪酸去飽和酶和延伸酶的研究已有報(bào)道［20－21］，但未見針對(duì)微擬球藻硫脂酶的研究。因此，探索微擬球藻硫脂酶的功能對(duì)全面認(rèn)識(shí)微擬球藻脂肪酸的合成機(jī)制至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)定了N.oceanica基因組序列，并注釋了硫脂酶基因［22］。我們發(fā)現(xiàn)注釋的硫脂酶氨基酸序列與其他物種硫脂酶氨基酸序列相似性較低，硫脂酶又缺少功能驗(yàn)證系統(tǒng)。為驗(yàn)證微擬球藻硫脂酶基因功能，本研究用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)分離了微擬球藻硫脂酶基因cDNA（NoTE），并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，根據(jù)大腸桿菌脂肪酸組成變化驗(yàn)證微擬球藻硫脂酶基因功能。本研究為深入探索硫脂酶在微擬球藻脂肪酸合成過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，為下一步通過基因工程手段調(diào)控微擬球藻脂肪酸代謝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微擬球藻培養(yǎng)

微擬球藻（N.oceanica）為中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，編號(hào)為LAMB 0001。將微擬球藻接種于250mL三角瓶中，內(nèi)裝有200mL高壓蒸汽滅菌后的f/2培養(yǎng)基［23］，于（23±1）℃、光強(qiáng)70 μmol·s－1·m－2、光周期12h∶12h、鹽度30、pH＝7.8條件下培養(yǎng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)注釋的NoTE設(shè)計(jì)引物，并引入酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI（下劃線）（見表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 NoTE擴(kuò)增引物Table 1 Primers used to amplify NoTE

1.3 微擬球藻硫脂酶基因克隆

用Trizol（Iinvitrogen公司）方法提取微擬球藻總RNA。用TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增NoTE。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min接94℃變性30s，66℃退火30s，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)和72℃延伸10min一個(gè)額外循環(huán)。用膠回收試劑盒（Omega公司）切膠純化PCR產(chǎn)物。與pEASY?-Blunt Cloning Vector（全式金公司）進(jìn)行T-A連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，PCR篩選陽性克隆并測(cè)序。

1.4 硫脂酶基因表達(dá)

提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒和pET-30a均用EcoRI和XhoI雙酶切，回收純化后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-NoTE，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），菌落PCR篩選陽性克隆并測(cè)序。

將重組子接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中［2］，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度0.5mmol/L，30℃誘導(dǎo)4h。4℃下5 000g離心收集菌體，用100μL蒸餾水重懸菌體，加入300μL 4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100℃煮沸20min，12 000g離心5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.5 重組子脂肪酸組成分析和含量測(cè)定

取35mL菌液，4℃下5 000g離心收集菌體，參照文獻(xiàn)［24］，在濕菌體中加入3mL萃取劑（甲醇∶氯仿＝1∶2），渦旋震蕩10min萃取細(xì)胞總脂，再加入5mL皂化試劑（水∶甲醇＝1∶4，含6%NaOH），60℃水浴1h，最后加入2mL甲酯化試劑（12%三氟化硼－甲醇溶液），60℃水浴30min，用1mL色譜純正己烷萃取脂肪酸甲酯，然后用AgiLent 6890Series GC Systerm（US10251016，USA）進(jìn)行GC分析。色譜條件為汽化室溫度250℃，空氣流量450mL/min，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），N2載氣，線速45mL/min，H2線速40mL/min，分流比10∶1，程序升溫170℃ （1min）升至210℃ （25min），每分鐘開3℃。以十五烷酸（Sigma公司）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微擬球藻硫脂酶基因表達(dá)

PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期大小相符的特異性條帶（見圖1）。測(cè)序顯示，插入T載體的DNA片段與NoTE預(yù)測(cè)序列一致。NJ進(jìn)化樹（見圖2）顯示，硫脂酶主要分為植物FatA和FatB，細(xì)菌硫脂酶以及幾個(gè)單獨(dú)的種類，而微擬球藻硫脂酶與它們的同源性較低，是獨(dú)立于它們之外的一類硫脂酶。

圖1 NoTE擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR product of NoTE

將NoTE從T載體上切下并連接到pET-30a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，用pET-30a特異性引物（5’-TCA AGA CCC GTT TAG AGG C-3’和 5’-TCA TTC TTC TGG TCT GGT GC-3’）菌落PCR擴(kuò)增獲得一條特異條帶（見圖3），與預(yù)期大小相符。測(cè)序顯示插入pET-30aDNA片段與NoTE序列一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組子誘導(dǎo)4h后，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在55kD處有一條特異條帶（見圖4），與預(yù)期蛋白大小相符，對(duì)照無特異條帶，說明NoTE已在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)。

2.2 重組子脂肪酸組成和含量

GC分析顯示重組子和對(duì)照脂肪酸組分相同，表明NoTE表達(dá)不改變大腸桿菌脂肪酸種類。但是，重組子脂肪酸定量（見圖5）顯示C14∶1、C16∶0、C16∶1、C18∶1及總脂肪酸含量與非重組子相比分別提高了11%、18%、32%、49%和30%，證明分離的基因確有硫脂酶活性，其表達(dá)能夠改變重組子脂肪酸含量，且微擬球藻硫脂酶傾向催化不飽和?；?ACP的水解，對(duì)C18∶1-ACP有很強(qiáng)活性。

圖2 微擬球藻和其他物種硫脂酶的Neighbor-joining樹Fig.2 The Neighbor-joining tree of the thioesterase of N.oceanicaand those of other species

圖3 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.3 PCR verification of recombinant plasmid

圖4 NoTE在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.4 Expression of NoTEin E.coli BL21（DE3）

圖5 NoTE表達(dá)對(duì)大腸桿菌脂肪酸含量的影響Fig.5 Changes in the contents of fatty acids of E.coli BL21（DE3）expressing NoTE

3 討論

本研究分離了微擬球藻一條硫脂酶基因，其功能尚未驗(yàn)證，因此，確定其功能對(duì)利用該基因調(diào)控微擬球藻的脂肪酸代謝至關(guān)重要。大腸桿菌遺傳背景清楚、表達(dá)系統(tǒng)成熟完善、繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定，其表達(dá)系統(tǒng)為驗(yàn)證NoTE的功能提供了一個(gè)合適的平臺(tái)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌做為表達(dá)宿主，通過SDS-PAGE檢測(cè)重組子，發(fā)現(xiàn)55kD處有一特異條帶，與預(yù)期蛋白大小相符，初步說明NoTE在大腸桿菌中成功表達(dá)。

通過氣相色譜對(duì)重組子進(jìn)行脂肪酸組成分析，GC數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌重組子脂肪酸種類雖未發(fā)生改變，但其總脂肪酸含量卻顯著增加，說明異源表達(dá)硫脂酶基因可顯著提高細(xì)菌總脂肪酸含量，這與文獻(xiàn)［3，25］的報(bào)道一致。另外，重組子C16∶1、C18∶1的含量顯著提高，這表明微擬球藻硫脂酶與植物FatA功能相似，主要水解不飽和酰基-ACP，并對(duì)C18∶1-ACP活性較強(qiáng)，而細(xì)菌硫脂酶對(duì)C6-C18?；?ACP/CoA活性更強(qiáng)［3，11］。本研究中，重組子C16∶0脂肪酸的含量也有一定程度的提高，說明微擬球藻硫脂酶也具有一部分植物FatB的功能，表明FatA和FatB的活性有部分是重疊的［25－26］。這些數(shù)據(jù)充分證明微擬球藻硫脂酶對(duì)不飽和?；?ACP有更強(qiáng)的親和力，主要水解C18∶1－ACP，并且與FatB的活性有一定重疊，也可以水解C16∶0-ACP。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏對(duì)真核蛋白質(zhì)的復(fù)性功能和修飾加工系統(tǒng)，更系統(tǒng)、全面的了解NoTE的功能還需要更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們擬純化重組蛋白，對(duì)該酶的底物特異性進(jìn)行分析；進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在微擬球藻中過量表達(dá)該基因，從而實(shí)現(xiàn)微擬球藻脂肪酸構(gòu)成的基因工程修飾。

本研究首次對(duì)NoTE的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究該酶基因的功能，并通過基因工程手段調(diào)控微擬球藻脂肪酸代謝，提高脂肪酸產(chǎn)量，改變脂肪酸組成提供了一定的基礎(chǔ)。

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