胡 鵬，劉新富，劉 濱，溫海深，楊 志，雷霽霖**

（1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264000）

紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）是中國北方海水養(yǎng)殖和出口創(chuàng)匯的重要魚類，養(yǎng)殖產(chǎn)量和產(chǎn)值最高達(dá)到8 000t和6億元［1］。近年來，隨著進(jìn)口國日本、韓國市場(chǎng)的飽和以及養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高，中國紅鰭東方鲀出口創(chuàng)匯競(jìng)爭(zhēng)力顯著下降，迫切需要改良品種和提升養(yǎng)殖技術(shù)以提高養(yǎng)殖效率和效益。紅鰭東方鲀的精巢是難得的珍貴食材，有“西施乳”的美譽(yù)，日本市場(chǎng)售價(jià)高達(dá)3 000～6 600日元/個(gè)［2］。因此，生產(chǎn)和養(yǎng)殖全雄紅鰭東方鲀，可以大幅度提高我國紅鰭東方鲀養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，增強(qiáng)產(chǎn)業(yè)國際競(jìng)爭(zhēng)力。

紅鰭東方鲀雌雄異體，性別決定機(jī)制為雄性異配（XY型）［3］，生產(chǎn)全雄苗種的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)是制備“超雄魚”親魚（遺傳型為YY型）。紅鰭東方鲀卵粒大、卵黃多，采用雄核發(fā)育技術(shù)生產(chǎn)超雄魚難度很大，較為可行的途徑是利用“偽雌魚”（遺傳性別為XY的雌魚）與正常雄魚交配產(chǎn)生“超雄魚”［4－5］。而誘導(dǎo)“偽雌魚”需要在稚、幼魚性別分化這一性別可塑的關(guān)鍵“窗口期”，利用外源激素或者環(huán)境條件改變誘導(dǎo)基因型為XY的稚、幼魚性反轉(zhuǎn)為“偽雌魚”。紅鰭東方鲀性腺分化發(fā)生的時(shí)間節(jié)點(diǎn)就成為其全雄苗種制種的關(guān)鍵基礎(chǔ)生物學(xué)信息之一。

迄今為止，有關(guān)紅鰭東方鲀性腺分化的組織學(xué)研究僅有2篇文獻(xiàn)，所報(bào)道2個(gè)日本地理種群的性腺分化起始時(shí)間分別為40～50日齡［6］和50日齡［7］。參考這些結(jié)果，在20～80日齡對(duì)中國沿岸土著紅鰭東方鲀種群人工繁育后代進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)，盡管17－α雌二醇口服用量較高（100～200μg/kg餌料），但是效果不理想，產(chǎn)生較高比例的間性性腺。為了摸清中國土著種群紅鰭東方鲀仔幼魚性腺分化的準(zhǔn)確時(shí)間節(jié)點(diǎn)，以便指導(dǎo)偽雌魚誘導(dǎo)，為全雄苗種制種技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，我們對(duì)山東日照沿海土著紅鰭東方鲀?nèi)斯し庇蟠男韵俜只^程進(jìn)行了組織學(xué)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2010 年春季捕撈自山東日照沿海的紅鰭東方鲀野生親魚，經(jīng)過1年的人工馴養(yǎng)和促熟培育，2011年4月采用LHRH-a催產(chǎn)，人工受精獲得受精卵。受精卵在17℃的水溫下孵化8～10d后，將孵出的初孵仔魚布池進(jìn)行培育，培育水溫為18～23℃。仔魚孵化后3日齡開口，18日齡進(jìn)入稚魚期，26日齡完成變態(tài)發(fā)育為幼魚，根據(jù)仔、稚和幼魚的生長情況，投喂輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體和配合飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從孵化后2～40日齡，每2d取樣1次，40～117日齡，每7d取樣1次，每次取樣30～40尾（見表1）。取樣的仔、稚和幼魚，2～40日齡樣品采用Bouin’s液固定，40日齡以后的樣品采用Davison液固定。樣品固定24h，50%乙醇將固定液沖洗干凈，置于70%乙醇中，4℃低溫密封保存。

固定的樣品，采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量樣品全長后，進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4～7μm），H.E染色，中性樹膠封片，OLYMPUS DP72顯微鏡進(jìn)行觀察、測(cè)量和拍照。

表1 紅鰭東方鲀仔、稚、幼魚樣品的日齡、數(shù)量和全長Table 1 Age，number and total length of the samples of larvae，juveniles and young fish of Takifugu rubripes

2 結(jié)果

2.1 原始性腺的發(fā)育

孵化后2～10日齡，仔魚全長2.73～3.42mm（n＝8），在中腎管下方和腸管之間的體腔膜附近觀察到成對(duì)出現(xiàn)的原始生殖細(xì)胞（見圖1A）。原始生殖細(xì)胞呈圓形或橢圓形，直徑（長徑）7.18～7.84μm；細(xì)胞質(zhì)呈嗜弱酸性；細(xì)胞核大且透亮，核膜清晰，核仁明顯，直徑4.29～5.59μm。

孵化后12～16日齡，仔魚全長3.59～6.76mm（n＝6），一對(duì)原始性腺形成（見圖1B～C），此時(shí)的原始性腺只含有2～3個(gè)原始生殖細(xì)胞和少量的體細(xì)胞，原始生殖細(xì)胞多呈圓形，直徑6.23～7.26μm，細(xì)胞核直徑4.12～5.36μm。這段時(shí)期仍能觀察到有原始生殖細(xì)胞向原始性腺遷移（見圖1C），遷移中的原始生殖細(xì)胞呈橢圓形，長徑6.92～7.57μm，細(xì)胞核直徑4.24～5.28μm。

孵化后18～38日齡，稚、幼魚全長7.15～17.33mm（n＝9），這段時(shí)期未發(fā)現(xiàn)有原始生殖細(xì)胞繼續(xù)向原始性腺遷移，原始性腺內(nèi)生殖細(xì)胞3～5個(gè)（見圖1D～E），隨著個(gè)體的發(fā)育，體細(xì)胞數(shù)量增多，原始性腺體積逐漸增大，原始性腺從背部體壁游離出來，通過性腺系膜與其相連（見圖1E）。在此過程中，不同個(gè)體間原始性腺大小和生殖細(xì)胞數(shù)目無明顯差異。

2.2 卵巢的分化和發(fā)育

孵化后40～47日齡，幼魚全長18.06～27.33mm，原始性腺體積進(jìn)一步增大，形態(tài)變化有2種趨向，其中一部分（n＝7）性腺形態(tài)特征與前一階段基本相同，另外一部分（n＝6）變化較大，兩葉性腺面向體腔側(cè)壁的一側(cè)上、下兩端體細(xì)胞開始增殖，向外突出，然后分別下彎和上彎相向生長，性腺面向體腔側(cè)壁的一側(cè)中部內(nèi)陷形成卵巢腔原基（見圖2A），此后兩端突起逐漸接近、融合，形成封閉的卵巢腔（見圖2B～C）。所觀察的樣品中，幼魚卵巢腔原基出現(xiàn)和腔體封閉的全長分別為18.06mm（40日齡）和25.26mm（47日齡）。在卵巢腔封閉的同時(shí)，卵原細(xì)胞也開始形成，細(xì)胞呈圓形，體積比原始生殖細(xì)胞小，直徑為5.29～5.99μm，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，細(xì)胞核直徑3.65～4.43μm（見圖2C）。

孵化后54～75日齡，幼魚全長32.48～48.48mm（n＝10），卵巢內(nèi)部產(chǎn)卵板開始形成，并逐步向卵巢腔內(nèi)延伸，同時(shí)卵原細(xì)胞沿產(chǎn)卵板外側(cè)邊緣分布，頻繁進(jìn)行有絲分裂形成卵原細(xì)胞群（見圖2D）。

孵化后82日齡，幼魚全長55.42～64.37mm（n＝4），少量卵原細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂初期，發(fā)育成為初級(jí)卵母細(xì)胞（見圖2E）。此時(shí)初級(jí)卵母細(xì)胞呈卵圓形，體積略大于卵原細(xì)胞，細(xì)胞直徑6.45～7.40μm，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性；細(xì)胞核明亮，直徑3.93～4.46μm。同時(shí)還觀察到少量初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育至周邊仁期（n＝3），細(xì)胞體積明顯增大，直徑9.37～12.45μm；細(xì)胞核大且較亮，直徑4.85～7.23μm，核仁3～6個(gè)（見圖2F）。

圖1 孵化后2～38日齡（全長2.73～17.33mm）紅鰭東方鲀?cè)夹韵侔l(fā)育Fig.1 Primary gonad development at 2～38dph（2.73～17.33mm TL）in Takifugu rubripes

圖2 孵化 后40～82日齡 （全 長18.06～64.37mm） 紅鰭 東方 鲀卵 巢分化Fig.2 Ovarian differentiation at 40～82dph（18.06～64.37mm）in Takifugu rubripes

2.3 精巢的分化和發(fā)育

孵化后47～54日齡，幼魚全長21.85～32.43mm（n＝9），沒有形成卵巢腔原基的原始性腺（見圖3A～B），性腺內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，但主要以體細(xì)胞為主，隨著性腺中央體細(xì)胞的增殖，原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移至性腺邊緣（見圖3B），原始生殖細(xì)胞直徑5.85～6.89μm，細(xì)胞核直徑3.16～3.96μm。

孵化后61日齡，幼魚全長30.63～41.85mm（n＝5），在性腺柄部形成裂縫狀的輸精小管，原始生殖細(xì)胞發(fā)育形成精原細(xì)胞，精原細(xì)胞呈圓形或卵圓形，直徑5.37～6.04μm，中央有一圓形細(xì)胞核，直徑2.51～2.94μm（見圖3C）；性腺邊緣的精原細(xì)胞增殖旺盛，精原細(xì)胞體積變小，直徑3.84～4.25μm，細(xì)胞核直徑2.24～2.69μm。同源精原細(xì)胞聚集在一起，形成一囊狀結(jié)構(gòu)，即精小囊（見圖3D）。

孵化后68～89日齡，幼魚全長42.85～67.42mm（n＝13），精巢邊緣的精原細(xì)胞不斷進(jìn)行有絲分裂，精原細(xì)胞數(shù)目增加，精小囊數(shù)量增多，精巢逐漸增大（見圖3E）。

孵化后103日齡，幼魚全長74.64～88.62mm（n＝4），少量精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期，形成初級(jí)精母細(xì)胞；初級(jí)精母細(xì)胞比精原細(xì)胞小，細(xì)胞質(zhì)基本不著色，細(xì)胞核嗜堿性強(qiáng)，核染色深，核仁較小不明顯（見圖3F）。

圖3 孵化后47～103日齡（全長21.85～88.62mm）紅鰭東方鲀精巢分化Fig.3 Testis differentiation at 47～103dph（21.85～88.62mm TL）in Takifugu rubripes

3 討論

依據(jù)原始性腺向卵巢和精巢分化前是否經(jīng)過“類似卵巢結(jié)構(gòu)”的過渡階段，可以將雌雄異體魚類的性腺分化方式分為直接分化和間接分化2種類型。已研究的魚類中，大多數(shù)雌雄異體魚類的性腺分化方式都屬于直接分化［8］，只有斑馬魚［9］和虎皮鲃［10］等少數(shù)魚類屬于間接分化。紅鰭東方鲀的卵巢和精巢，直接分化自幼魚期的原始性腺，中間沒有經(jīng)過“類似卵巢結(jié)構(gòu)”的過渡性腺階段，其性腺分化方式與大多數(shù)魚類相似，屬于直接分化類型。

雌雄異體的硬骨魚類，種類不同，其性別分化過程差異較大，判斷其性別組織學(xué)分化起始時(shí)期的依據(jù)主要包括：1）原始性腺即將開始分化時(shí)所含生殖細(xì)胞的數(shù)目。有些魚類，如青鳉［11］和三刺魚［12］，向卵巢方向分化的原始性腺中生殖細(xì)胞數(shù)量比向精巢方向分化的要多。2）生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動(dòng)。許多魚類生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)的時(shí)期早于解剖學(xué)結(jié)構(gòu)（如卵巢腔）的形成［13］。3）卵巢腔和輸精小管等解剖學(xué)特征的形成［14－17］。本研究的結(jié)果表明，紅鰭東方鲀性腺分化初期，原始性腺中的生殖細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的性別差異；卵巢腔在40日齡（全長18.06mm）時(shí)開始出現(xiàn)原基，至47日齡（全長25.26mm）時(shí)即分化完成，而輸精小管在61日齡（全長33.62mm）時(shí)出現(xiàn)，分別早于卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間（82和103日齡）。因此，采用卵巢腔（原基）和輸精小管的形成分別作為紅鰭東方鲀卵巢和精巢分化的標(biāo)志比較合理。

與大多數(shù)魚類一樣，紅鰭東方鲀卵巢先于精巢開始分化，其開始分化的時(shí)期，本研究結(jié)果為孵化后40日齡（全長18mm左右），比2位日本學(xué)者確定的45日齡［6］和50日齡［7］要早。但是從全長來看，鈴木等的研究結(jié)果為18.26～23.61mm，松浦等雖然沒有給出幼魚全長，但是推測(cè)也在18mm左右，與我們的研究結(jié)果基本一致，中、日3個(gè)地理種群的卵巢分化開始時(shí)間沒有顯著差別。至于精巢開始分化的時(shí)間，依據(jù)輸精小管形成的時(shí)間，本研究確定為61日齡（全長33.62mm），2位日本學(xué)者研究分別為75日齡（缺乏全長數(shù)據(jù)）［6］和80日齡（全長58.26～77.36mm）［7］，分歧比較大，但是三者所觀察到的初級(jí)精母細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)期非常一致（100日齡左右）。造成這些分歧的原因，可能是此階段（60～100日齡）紅鰭東方鲀雄魚的輸精小管等精巢特有結(jié)構(gòu)比較細(xì)微，采用石蠟切片技術(shù)不容易觀察，而與地理種群的差異無關(guān)。

根據(jù)本研究的結(jié)果，中國沿海紅鰭東方鲀卵巢的分化時(shí)期為40～82日齡，精巢的分化時(shí)期為61～103日齡。因此，我們?cè)诖饲暗摹皞未启~”誘導(dǎo)試驗(yàn)中，所選擇的誘導(dǎo)時(shí)期20～80日齡，只涵蓋了性腺分化的起點(diǎn)，但是沒有涵蓋精巢分化的終點(diǎn)，可能成為誘導(dǎo)結(jié)束后出現(xiàn)間性性腺的原因。另外，通常仔幼魚的性腺分化時(shí)期，與體長的關(guān)系比同日齡的關(guān)系更加密切［5，18－19］，選擇誘導(dǎo)時(shí)期的時(shí)候還需要考慮溫度等因素造成的生長差異，以及個(gè)體間的生長差異。

4 結(jié)語

中國土著紅鰭東方鲀?nèi)斯し庇蟠韵俚慕M織學(xué)分化過程與日本種群差別不大。孵化后2日齡（全長2.69mm）原始生殖細(xì)胞遷移至消化道背部和中腎管之間，孵化后12日齡（全長3.59mm）原始性腺形成；孵化后40～82日齡（全長18.06～55.42mm）卵巢分化，其起始和結(jié)束的標(biāo)志分別為卵巢腔原基形成和初級(jí)卵母細(xì)胞出現(xiàn)；孵化后61～103日齡（全長33.62～67.45mm）精巢分化，其起始和結(jié)束的標(biāo)志分別為輸精小管形成和初級(jí)精母細(xì)胞的出現(xiàn)。本文的研究結(jié)果為研究紅鰭東方鲀性別控制和全雄苗種制種技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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