連姍姍，李 雪，邢 強，趙柏淞，張玲玲，包振民

（中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003）

據(jù)中國漁業(yè)報2011年統(tǒng)計，中國扇貝年養(yǎng)殖產(chǎn)量可達(dá)到世界扇貝類年養(yǎng)殖業(yè)總產(chǎn)量的80%［1］，其中，櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）是中國重要的本土經(jīng)濟優(yōu)勢種，自然分布于山東半島和遼東半島沿海地區(qū)。近年來，養(yǎng)殖區(qū)櫛孔扇貝在夏季頻繁出現(xiàn)大規(guī)模死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。調(diào)查顯示，櫛孔扇貝大規(guī)模死亡發(fā)生在夏季高溫期，持續(xù)時間久，從6月中旬至9月底時有發(fā)生，7月中旬形成高峰，平均死亡率達(dá)到35%～40%，有的地區(qū)甚至高達(dá)70%［2－4］。除櫛孔扇貝以外，中國南北沿海養(yǎng)殖的海灣扇貝（Argopectenirradians）、合浦珠母貝（Pinctadamartensii）、牡蠣（Crassostreaspp.）、鮑（Haliotisspp.）等海洋貝類也爆發(fā)過不同程度的夏季大規(guī)模死亡［5－6］，此外，在日本、美國、法國等國都有關(guān)于海洋貝類夏季頻發(fā)大規(guī)模死亡的報道［7－8］，由此可見，夏季大規(guī)模死亡已嚴(yán)重制約了全球貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

關(guān)于櫛孔扇貝養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的夏季大規(guī)模死亡現(xiàn)象，很多研究者認(rèn)為環(huán)境可能是重要的誘因［3，9］。夏季養(yǎng)殖海區(qū)的不良環(huán)境理化因子，包括不適的溫度、鹽度、PH、溶解氧等，均會對養(yǎng)殖貝類產(chǎn)生脅迫刺激。研究顯示，在其他環(huán)境因子良好的情況下，海水溫度過高可導(dǎo)致櫛孔扇貝死亡，且扇貝的死亡率隨著高溫刺激時間的延長而升高［10］。因而，高溫被認(rèn)為是引發(fā)扇貝大規(guī)模死亡的主要環(huán)境因素。高溫對于生物的影響是多方面的，可以造成機體分解代謝增強，合成代謝下降，引發(fā)生長停滯，免疫力下降等［11－13］。

2007 年Royer等的研究發(fā)現(xiàn)，太平洋牡蠣死亡高峰期恰好出現(xiàn)在產(chǎn)卵之后［14］，暗示著除了高溫以外，繁殖也可能是引發(fā)海洋貝類夏季大規(guī)模死亡的重要原因。已有研究顯示，繁殖導(dǎo)致太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、貽貝（Mytilusedulis）、海灣扇貝（A.irradians）等海洋貝類的氧氮比迅速下降，表明該階段機體代謝消耗了大量的蛋白質(zhì)［14－17］。此外，對美洲牡蠣（Crassostreavirginica）和歐洲猿頭蛤（Chameleagallina）的研究顯示，繁殖后機體內(nèi)血細(xì)胞的免疫活性明顯降低［18－19］。這些研究結(jié)果表明，繁殖過程需要消耗大量的能量，會影響機體生理功能的正常行使，導(dǎo)致機體免疫力下降。類似的，櫛孔扇貝的養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，大規(guī)模死亡主要爆發(fā)于性成熟、且處于繁殖期的2齡及2齡以上養(yǎng)殖群體中，但是到目前為止，關(guān)于繁殖對櫛孔扇貝影響的研究還鮮有報道。

早在1956年，哈曼就提出了代謝相關(guān)的自由基學(xué)說［20］，認(rèn)為機體正常生長、代謝過程中所產(chǎn)生的活性氧自由基ROS可以引發(fā)氧化損傷，影響組織正常新陳代謝及功能的維持，甚至引發(fā)疾病，顯著影響生物體的體質(zhì)活力狀態(tài)和抗逆性［21－22］。為了使生物體內(nèi)ROS保持在對機體無害的水平，生物體必須及時清除過量的ROS。超氧化物歧化酶SOD就是ROS清除系統(tǒng)中的重要成員，它可通過催化細(xì)胞內(nèi)的超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)［23］，降低細(xì)胞ROS的水平，因而SOD是反映機體抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。本研究將利用實時定量PCR法分析繁殖和高溫脅迫后CuZnSOD和Mn-SOD兩種SOD基因的表達(dá)變化，探討繁殖和高溫對櫛孔扇貝抗氧化能力的影響，為揭示海洋雙殼類動物夏季大規(guī)模死亡的原因提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用櫛孔扇貝均為2齡，于4月采自山東榮成的扇貝養(yǎng)殖場。新鮮的扇貝按照標(biāo)準(zhǔn)的流程［24］由榮成養(yǎng)殖場運回實驗室，在15℃的過濾海水中暫養(yǎng)1周。本實驗設(shè)計分對照組（Control）和實驗組，對照組100只，養(yǎng)殖條件不變，實驗組分2組，各100只，分別進(jìn)行繁殖實驗及高溫刺激實驗。繁殖實驗采用陰干法進(jìn)行催產(chǎn)，繁殖后（Post-reproduction）的扇貝一部分用于取材，剩余的在15℃過濾海水中充氣暫養(yǎng)，12h投餌1次，恢復(fù)1個月后（After one month recovery）取材，然后對剩余的扇貝個體進(jìn)行陰干催產(chǎn)，再次繁殖后（After second reproduction）的個體用于取材。高溫刺激實驗12h內(nèi)由15℃升溫至30℃，并維持30℃的持續(xù)高溫刺激，期間對樣品死亡率進(jìn)行統(tǒng)計；在死亡率超過50%（刺激持續(xù)約12.5h）時進(jìn)行取材。每次取材隨機挑選6個個體，取其外套膜、鰓、性腺、腎臟、閉殼肌和肝胰腺，液氮速凍后置于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 采用異硫氰酸胍法進(jìn)行組織總RNA的提取。所有用于RNA提取的玻璃、金屬制品均在180℃下烘烤6h以上以滅活RNA酶，離心管、移液器吸頭等塑料耗材則用1%DEPC·H2O浸泡24h以上，高溫滅菌后烘干備用。取適量（約50mg）液氮保存的組織塊置入冰上預(yù)冷的含β－巰基乙醇的溶液D中，高速勻漿后進(jìn)行酚氯仿抽提。利用RNase-free H2O將異丙醇沉淀得到的RNA完全溶解后，加入5μL 10×DNase I buffer，1μL DNase I（5U/μL）以及1μL RNasin（40U/μL），用 RNase-free H2O 補至50μL，混勻，37℃水浴30min消化基因組DNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并利用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。

1.2.2 第一鏈cDNA合成 取2μg總RNA，加入1μL 20μmol/L Oligo d（T）18，用 DEPC無菌水補至13μL，混勻。70℃10min后立即置于冰上。低速離心后，加入5μL 5×M-MLV buffer，5μL 2.5mmol/L dNTP，1 μL 40U/μL RNasin 和 1 μL 200U/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega，Madison，WI，USA），混勻離心，42℃反應(yīng)90min；94℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。所獲得的cDNA分裝于PCR管中（2μL/管），－20℃保存。

1.2.3 實時定量PCR法測定基因相對表達(dá)量 實時定量PCR反應(yīng)體系共20μL，包括10倍稀釋的一鏈cDNA 2μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，Osaka，Japan）10μL以及正反向引物（2.5μmol/L）各4μL。PCR 反應(yīng)在 ABI 7500realtime PCR System（Applied Biosystems，CA，USA）上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：Stage 1，50℃2min；Stage 2，94℃3min；Stage 3，進(jìn)行94℃ 30s62.8℃ 30s，72℃30s，共40個循環(huán)；Stage 4，檢測溶解曲線95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。實驗中共選取3個內(nèi)參 基 因：β-actin（ACTB），elongation factor 1beta（EF1β）以及ribosomal protein L16（RPL16），目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的引物序列見表1。所得到的熒光信號利用SDS軟件（Applied Biosystems）及在線軟件realtime PCR Miner 4.0（http：//www2.miner.ewindup.info/）［25］進(jìn)行分析，根據(jù) Vandesompele的方法，即將所選擇的多種看家基因的幾何均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化因子從而標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)［26－27］，計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用單因素方差分析比較不同組織間及繁殖實驗不同組間數(shù)據(jù)差異的顯著性，對于差異顯著（P＜0.05）的數(shù)據(jù)，利用 Fisher′s least significant difference（LSD）法進(jìn)行兩兩比較。高溫脅迫前后的數(shù)據(jù)差異用雙尾T檢驗分析。以上分析均在SPSS 16.0統(tǒng)計軟件［28］中實現(xiàn)，P＜0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 組織類型對櫛孔扇貝CuZnSOD和MnSOD表達(dá)的影響

首先，利用單因素方差分析檢測不同組織之間CuZnSOD表達(dá)的區(qū)別。如圖1所示，CuZnSOD的表達(dá)水平在不同組織之間差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步分析表明，該基因在性腺中的表達(dá)水平顯著低于鰓和腎臟（P＜0.01）。利用同樣的方法分析MnSOD的表達(dá)水平，結(jié)果顯示MnSOD在不同組織中也顯著差異（P＜0.05），但與CuZnSOD不同，MnSOD在外套膜和肝胰腺中的表達(dá)水平較高，與鰓、性腺、閉殼肌及腎臟中的表達(dá)水平具有顯著差異（P＜0.001）。

表1 SOD基因及內(nèi)參基因引物序列信息Table 1 Primer sequences of SOD and internal control genes used for real-time PCR

2種SOD基因總體表達(dá)水平的比較結(jié)果顯示，櫛孔扇貝各組織中CuZnSOD的表達(dá)水平均顯著高于MnSOD（P＜0.05）。綜上所述，CuZnSOD和MnSOD在櫛孔扇貝各組織中廣泛表達(dá)，但2種SOD基因的表達(dá)水平在不同組織間均具有明顯差異，在后續(xù)的繁殖及高溫實驗中應(yīng)對不同組織進(jìn)行具體分析。

圖1 櫛孔扇貝CuZnSOD和MnSOD的組織表達(dá)水平Fig.1 Relative expression levels of CuZnSODand MnSODin various tissues of Chlamys farreri

2.2 繁殖對櫛孔扇貝各組織CuZnSOD和MnSOD表達(dá)的影響

圖2顯示了繁殖前后櫛孔扇貝各組織2種SOD基因表達(dá)水平的變化趨勢。如圖2a所示，繁殖后，CuZn-SOD的表達(dá)水平在外套膜、鰓、性腺、腎臟、閉殼肌及肝胰腺6種組織均大幅下降，且差異顯著（P＜0.05）；其中，外套膜、鰓、腎臟和肝胰腺中CuZnSOD的表達(dá)水平經(jīng)過1個月的恢復(fù)期后有上升趨勢，但未能恢復(fù)至對照水平；再次繁殖后，CuZnSOD表達(dá)水平下降，但與繁殖后及恢復(fù)期相比，沒有顯著差異。

如圖2b所示，繁殖后，MnSOD的表達(dá)水平雖然在6種組織中均呈現(xiàn)下降趨勢，但僅在鰓和腎臟中呈顯著下降（P＜0.05）；恢復(fù)1個月后，鰓和腎臟的MnSOD表達(dá)水平與繁殖后相比未有上升，仍顯著低于對照（P＜0.05）；再次繁殖后，這2種組織的MnSOD表達(dá)水平進(jìn)一步下降，但與繁殖后及再次繁殖前的恢復(fù)期相比，均沒有顯著差異。外套膜中MnSOD的表達(dá)水平在繁殖后下降；在恢復(fù)期有所回升，但均與對照沒有顯著差異；再次繁殖后MnSOD表達(dá)量降低，顯著低于對照（P＜0.05），但與繁殖后及恢復(fù)期相比，差異并不顯著。

2.3 高溫對櫛孔扇貝各組織CuZnSOD和MnSOD表達(dá)水平的影響

30℃高溫脅迫后對櫛孔扇貝死亡率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，持續(xù)脅迫6h，扇貝死亡率為13.16%；6h后死亡率開始出現(xiàn)大幅上升，脅迫12.5h時扇貝死亡率達(dá)到62.28%；脅迫18h時扇貝死亡率高達(dá)98.68%（見圖3a）。

雙尾T檢驗結(jié)果表明，高溫脅迫后CuZnSOD的表達(dá)水平在6種組織中均明顯下降，在鰓、性腺、腎臟及閉殼肌中下降顯著（P＜0.05）（見圖3b）；高溫脅迫后MnSOD的表達(dá)水平在除閉殼肌以外的五種組織中均出現(xiàn)下降，在外套膜、鰓和腎臟中下降顯著（P＜0.05）（見圖3c）。由此可見，高溫脅迫后2種SOD基因的表達(dá)水平在鰓及腎臟2種組織中均顯著下降，表明高溫脅迫嚴(yán)重影響了這2種組織的抗氧化能力。

圖2 繁殖前后櫛孔扇貝CuZnSOD和MnSOD在各組織中的表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of CuZnSODand MnSODbefore and after reproduction in various tissues of Chlamysfarreri

圖3 高溫脅迫下櫛孔扇貝死亡率曲線（a）及各組織CuZnSOD（b）和MnSOD（c）的表達(dá)水平Fig.3 Motality curve of C.farreri under 30℃stimulation（a）and relative expression levels of CuZnSOD （b）and MnSOD （c）in various tissues

3 討論

活性氧自由基ROS可以由生物體正常代謝活動產(chǎn)生，也可以由侵犯機體的不良外界環(huán)境因子誘發(fā)產(chǎn)生，具有極強的氧化性，可引發(fā)組織細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過氧化反應(yīng)，造成氧化損傷，與代謝紊亂、組織癌變、細(xì)胞衰老、凋亡等密切相關(guān)［21］。為了應(yīng)對ROS所引起的損傷，真核細(xì)胞發(fā)展了許多機制用于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，其中第一道防御體系就是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)［29－30］。真核生物的超氧化物歧化酶SOD即為抗氧化酶系統(tǒng)中的重要成員，SOD可根據(jù)金屬輔基的不同分為2類：一類含Cu和Zn離子（CuZn-SOD），主要存在于細(xì)胞的胞質(zhì)以及胞外［31］；另一類含Mn離子（MnSOD），主要存在于線粒體中［32］。研究表明，生物體的SOD酶活性水平與機體的衰老及新陳代謝率顯著相關(guān)［33］。此外，SOD還與基因組DNA穩(wěn)定性有關(guān)，可參與調(diào)節(jié)ROS生成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控［34］。

本研究結(jié)果表明，CuZnSOD和MnSOD在櫛孔扇貝中均具有廣泛的組織表達(dá)，與其他水生生物的研究結(jié)果相符［35－38］。櫛孔扇貝各組織中CuZnSOD的表達(dá)水平高于MnSOD，表明組織中胞質(zhì)及胞外型的SOD要多于線粒體型SOD。另外，櫛孔扇貝中性腺組織的CuZnSOD表達(dá)水平相對較低，與前期研究相符［37］，推測可能與該組織細(xì)胞分裂活性較低有關(guān)；肝胰腺作為扇貝的能量調(diào)控中心，其線粒體型MnSOD基因表達(dá)水平相對較高，推測可能與該組織活躍的能量代謝有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，繁殖后SOD基因的表達(dá)水平在櫛孔扇貝各組織中均顯著下降，與太平洋牡蠣的研究結(jié)果相符［39］。經(jīng)過1個月的恢復(fù)期，2種SOD基因的表達(dá)水平仍未能恢復(fù)至對照水平，這表明繁殖大大降低了扇貝機體的抗氧化能力，扇貝可能需要較長的時間才能恢復(fù)體質(zhì)。前期研究表明，在低等的果蠅乃至高等的鳥類、哺乳動物中均存在繁殖過程中生物體機體抗氧化能力下降、組織氧化損傷加劇的現(xiàn)象［40－43］，海洋貝類也不例外［44－45］。生物體抗氧化能力的下降會顯著影響機體的正常代謝活動及生理功能，例如，研究表明，繁殖過程中機體組織抗氧化酶活性下降、細(xì)胞的氧化損傷加劇可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素［46］，而且機體繁殖過程中由于抗氧化能力下降所產(chǎn)生的ROS可降低細(xì)胞的吞噬活性，影響機體清除損傷細(xì)胞、進(jìn)行組織修復(fù)的功能［47－48］。在加拿大海扇貝中（Placopectenmagellanicus）的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)卵后機體的新陳代謝率顯著低于正常個體［49］，我們推測這可能是導(dǎo)致繁殖后組織SOD基因轉(zhuǎn)錄活性下降的原因之一。

除繁殖因素外，海洋貝類的研究表明，提高環(huán)境溫度會顯著影響海洋雙殼貝類機體生理生化過程，進(jìn)而影響扇貝個體的代謝率［50］。對扇貝Argopectenventricosus的研究表明，在非致死高溫刺激下（19～22℃）下扇貝的代謝率上升，而在更高的溫度（25～28℃）持續(xù)刺激下，扇貝機體的代謝率反而下降［51］。另外，在無脊椎動物中的研究表明，高溫脅迫會引發(fā)線粒體功能障礙，導(dǎo)致機體供能不足［52－53］。本研究顯示，30℃持續(xù)刺激18h，櫛孔扇貝的死亡率達(dá)到80%以上，屬于致死性高溫刺激，因此，高溫脅迫下扇貝線粒體功能障礙引發(fā)代謝率下降也可能是導(dǎo)致2種SOD基因表達(dá)水平下降的主要原因。綜合分析，本研究認(rèn)為高溫和繁殖影響櫛孔扇貝機體內(nèi)多個組織CuZnSOD和MnSOD基因的轉(zhuǎn)錄，降低了扇貝的抗氧化能力，這可能是導(dǎo)致櫛孔扇貝夏季大規(guī)模死亡的重要內(nèi)因。

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