劉 路, 彭正軍, 韋 曦, 許喆楨

(中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室, 廣東 廣州 510055)

·基礎(chǔ)研究·

牙乳頭/牙囊細(xì)胞交互作用對細(xì)胞多能性的作用

劉 路, 彭正軍, 韋 曦, 許喆楨

(中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室, 廣東 廣州 510055)

目的: 研究細(xì)胞交互作用對細(xì)胞多能性的調(diào)控作用。方法：建立牙乳頭(DPCs)和牙囊細(xì)胞(DFCs)體外共培養(yǎng)模型，二者單獨培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組。采用細(xì)胞計數(shù)、β- gal染色檢測細(xì)胞生長和衰老情況；免疫熒光染色檢測共培養(yǎng)條件下多能性相關(guān)因子Oct- 4、Sox2和c- Myc的表達(dá)變化；通過ALP活性測試檢測礦化誘導(dǎo)后的DPCs和DFCs的礦化能力。結(jié)果：共培養(yǎng)組的DPCs和DFCs的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)至第7代時，共培養(yǎng)組的DPCs、DFCs中與衰老相關(guān)的SA- b- gal表達(dá)較對照組明顯減弱(P<0.05)；Oct- 4、Sox2和c- Myc在共培養(yǎng)組DPCs和DFCs中的表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組；共培養(yǎng)組的DPCs和DFCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)14、21 d后，其ALP活性均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論：DPCs和DFCs可通過體外交互作用抑制細(xì)胞衰老、促進(jìn)細(xì)胞的多能性相關(guān)因子的表達(dá)、提高細(xì)胞的礦化能力。

牙乳頭細(xì)胞; 牙囊細(xì)胞; 微環(huán)境; 多能性

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):63]

牙乳頭細(xì)胞(dental papilla cells，DPCs)和牙囊細(xì)胞(dental follicle cells, DFCs)均來自外胚間充質(zhì)，具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化潛能[1]。DPCs和DFCs作為牙髓細(xì)胞和牙周韌帶細(xì)胞的前體細(xì)胞，在牙發(fā)育和再生中具有重要作用，是構(gòu)建生物牙根的種子細(xì)胞。然而，DPCs和DFCs干細(xì)胞比例低，難以純化篩選，從而限制了其在口腔再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[1]。由于細(xì)胞性能由內(nèi)源性信號和細(xì)胞外微環(huán)境共同決定，通過改變細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境和細(xì)胞間交互作用，在提高前體細(xì)胞多能性，改善其性能，優(yōu)化種子細(xì)胞后，可應(yīng)用于組織修復(fù)再生。但細(xì)胞間及細(xì)胞-微環(huán)境間的具體作用機(jī)制尚未明確[2]。

本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，體外傳代培養(yǎng)過程中擴(kuò)增早期的牙髓細(xì)胞中多能性因子Oct- 4、Sox2和c- Myc的表達(dá)水平較高，此后其表達(dá)隨細(xì)胞傳代而下降，并最終消失；細(xì)胞的多能性亦隨傳代而下降[3]。能否模擬體內(nèi)牙齒發(fā)育的微環(huán)境，通過DPCs與DFCs的交互作用調(diào)控細(xì)胞的性能，目前尚未明確。因此，本實驗分別采用β- gal染色、免疫熒光染色和ALP活性檢測等方法，觀察DPCs與DFCs交互作用對細(xì)胞生長、衰老、多能性相關(guān)因子表達(dá)和分化能力的影響，以探討細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境對牙源性細(xì)胞未分化性能的調(diào)控作用，并為口腔種子細(xì)胞在牙再生的臨床應(yīng)用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

特級胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Gibeco- BRL, 荷蘭)；α- MEM培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶(Worthington, 美國)；Dispase(GIBCO- BRL, 荷蘭)；2.5 g/L胰蛋白酶(Sigma, 澳大利亞); 豬血清(Dako，澳大利亞)；鼠抗人Oct- 4單克隆抗體(Chemicon,美國)；鼠抗人Sox2單克隆抗體(R&D System，美國)；鼠抗人c- Myc單克隆抗體(Santa cruz，美國)；熒光二抗、DAPI(Invitrogen，澳大利亞)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(南京建成公司); Transwell 小室(Corning, Tewksbury, MA, 美國); 膠室玻片(chamber slides，Nunc, 美國)。

1.2 方法

1.2.1 DPCs和DFCs細(xì)胞體外培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[1]報道的方法體外培養(yǎng)出生后7 d SD大鼠(中山大學(xué)動物實驗中心)的DPCs和DFCs：顯微鏡下取大鼠磨牙牙胚并分離取出牙乳頭和牙囊組織，分別浸泡于含青霉素500 U/mL、鏈霉素500 μg/mL的PBS溶液中將其剪碎后，以1 ∶1的比例加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL的dispase酶37 ℃消化20～45 min終止消化后，用含200 mL/L FBS的α- MEM重懸細(xì)胞并分別接種于6孔培養(yǎng)板，置于50 mL/L CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h半量換液，以后每3 d 換液1次，待細(xì)胞匯合達(dá)70%～80%時，2.5 g/L 胰酶消化，1 ∶3傳代。

1.2.2 建立DPCs和DFCs體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型

采用孔徑為0.4 mm的Transwell小室建立DPCs和DFCs體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型：將DPCs和DFCs以1×103/孔 的細(xì)胞密度分別接種于共培養(yǎng)模型組小室的上下層(對照組小室的上下層均為同種細(xì)胞)，并同時加入含100 mL/L FBS的α- MEM，置于50 mL/L CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h半量換液，以后每3 d換液1次。

1.2.3 細(xì)胞計數(shù)

上述培養(yǎng)5 d后，分別取共培養(yǎng)組和對照組的DPCs和DFCs，用2.5 g/L胰酶消化、PBS洗凈后重懸于10 mL培養(yǎng)基中； 然后取50 μL各細(xì)胞懸液，分別加入50 μL臺盼藍(lán)進(jìn)行染色后，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 β- gal染色檢測細(xì)胞衰老

采用與細(xì)胞衰老相關(guān)的β- gal染色法(Beta-galactosidase staining)檢測各組細(xì)胞的衰老情況。分別取共培養(yǎng)組和對照組的第3、7代DPCs和DFCs，以1×103/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板，并用PBS洗凈；然后按照β- galactosidase試劑盒(Cell Signaling Technology)說明書，在每孔中加入pH=6.0的X- gal發(fā)色底物，37 ℃下培養(yǎng)過夜；熒光顯微鏡下觀察與衰老相關(guān)的SA- b- gal的表達(dá)情況。

1.2.5 免疫細(xì)胞熒光染色

分別收集對照組和共培養(yǎng)組的第5代DPCs和DFCs，以1×104/mL 細(xì)胞密度接種于膠室玻片，用30 g/L多聚甲醛固定15 min后, 滴加1 g/L Triton常溫處理20 min； 100 mL/L豬血清常溫封閉1 h； 然后再分別滴加Oct- 4單克隆抗體、Sox2單克隆抗體、c- Myc單克隆抗體，并置于濕盒4 ℃過夜； PBS漂洗3次后，用熒光標(biāo)記的二抗(1 ∶150)常溫處理3 h; 再次用PBS漂洗3次后滴加DAPI(1 ∶1 400)，并用100 g/L甘油封片。最后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，并用Axion圖像分析軟件分析Oct- 4、Sox2、c- Myc 在DPCs和DFCs中的表達(dá)、分布情況。

1.2.6 礦化誘導(dǎo)和ALP活性測試

共培養(yǎng)組和對照組細(xì)胞生長至80%匯合時換用礦化誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β甘油磷酸鈉、0.2 mmol/L抗壞血酸、100 nmoL/L 地塞米松、150 mL/L FBS的α- MEM)繼續(xù)培養(yǎng)；并分別于培養(yǎng)0、7、14、21 d各時間點，采用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測ALP活性。具體步驟如下：分別取共培養(yǎng)組和對照組的DPCs和DFCs，用PBS洗凈3次后加入1 mL含1 g/L Triton X-100的 10 mmol/L Tris- HCl緩沖液，超聲震蕩40 s(重復(fù)5次)；4 ℃離心15 min后，取50 mL上清液轉(zhuǎn)移至24孔板，同時加入100 mL ALP底物與之混合后置于37 ℃靜置30 min；加入50 mL 0.2 mol/L NaOH終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測各孔 410 nm 波長處的吸光度值，以間接反映各組細(xì)胞的ALP活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

細(xì)胞計數(shù)顯示，共培養(yǎng)組的DPCs和DFCs細(xì)胞數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)(圖1)。β- gal染色顯示：培養(yǎng)第3代時，共培養(yǎng)組的DPCs(圖2b)、DFCs(圖2f)和對照組的DPCs(圖2a)、DFCs(圖2e)均無明顯染色，即與衰老相關(guān)的SA- b- gal呈陰性表達(dá)；培養(yǎng)第7代時，對照組的DPCs(圖2c)和DFCs(圖2g)均強(qiáng)陽性表達(dá)SA- b- gal(藍(lán)色染色)，而共培養(yǎng)

組的DPCs(圖2d)和DFCs(圖2h)僅部分細(xì)胞中SA- b- gal呈極弱的陽性表達(dá)(藍(lán)色染色)。以上結(jié)果提示，傳代后期的DPCs和DFCs可通過細(xì)胞交互作用抑制細(xì)胞衰老。

培養(yǎng)第5代時免疫細(xì)胞熒光染色顯示，Oct- 4(圖3a、b、g、h)、Sox2(圖3c、d、i、j)和c- Myc(圖3e、f、k、l)在共培養(yǎng)組的DPCs(圖3b、d、f)和DFCs(圖3h、j、l)中的表達(dá)均顯著強(qiáng)于對照組(圖3a、c、e、g、i、k)； 且均為細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)，細(xì)胞漿弱表達(dá)(綠色熒光)(圖3)。

共培養(yǎng)組和對照組的DPCs、DFCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)0～21 d不同時間后，ALP檢測結(jié)果顯示：各組各細(xì)胞的ALP活性均呈時間依賴性增長；共培養(yǎng)組各細(xì)胞與對照組各細(xì)胞的ALP活性相比，除礦化誘導(dǎo)0、7 d時兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)外，其他各時間點均為共培養(yǎng)組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

*與對照組相比P<0.05

a、b為第3代DPCs對照組和共培養(yǎng)組； c、d為第7代DPCs對照組和共培養(yǎng)組; e、f為第3代DFCs對照組和共培養(yǎng)組; g、h為第7代DFCs對照組和共培養(yǎng)組; 第3代時，各組各細(xì)胞均無明顯染色(a、b、e、d)； 第7代時，對照組DPCs(c)和DFCs(g)中SA- b- gal均呈強(qiáng)陽性表達(dá)(藍(lán)色)，而共培養(yǎng)組的DPCs(d)和DFCs(h)中SA- b- gal均呈極弱的陽性表達(dá)

圖2 對照組和共培養(yǎng)組DPCs和DFCs β-gal染色(×100)

Oct-4(a、b、g、h)、Sox2(c、d、i、j)和c-Myc(e、f、k、l)在共培養(yǎng)組的DPCs(b、d、f)和DFCs(h、j、l)中的表達(dá)均顯著強(qiáng)于對照組(a、c、e、g、i、k)，且均為細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)，在細(xì)胞漿弱表達(dá)(綠色熒光)

圖3 各組DPCs和DFCs中Oct-4、Sox2、c- Myc的表達(dá)(免疫細(xì)胞熒光染色，×200)

圖4 礦化誘導(dǎo)后各組DPCs和DFCs的ALP活性比較(*與對照組相比P<0.05)

3 討論

前體/干細(xì)胞存在于某種特定的微環(huán)境內(nèi)，與環(huán)境相互作用、相互依存。一旦脫離了該微環(huán)境，或微環(huán)境發(fā)生了改變，細(xì)胞性能將受到影響，干性降低甚至喪失[4]。近年來有學(xué)者提出，通過優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件和細(xì)胞微環(huán)境，可改良細(xì)胞的干性，甚至能誘導(dǎo)細(xì)胞重編程為未分化的前體細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，熱刺激、低氧、缺血及氧化等應(yīng)激狀態(tài)可激活相關(guān)信號通路，從而促使已分化的體細(xì)胞重編程為未分化狀態(tài)的前體/干細(xì)胞，并行使其修復(fù)功能[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可激活Oct4啟動子受體，促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)記物 TRA1- 60和SSEA4的表達(dá)，提高其自我更新和畸胎瘤形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞重編程[6]。然而，微環(huán)境改變對細(xì)胞重編程的研究尚處于起步階段，其分子機(jī)制、信號通路交匯點、重編程與微環(huán)境的關(guān)系尚未明確。

滋養(yǎng)層細(xì)胞(feeder layer)用作底物同化培養(yǎng)液，可為細(xì)胞生長提供必要的生長因子，并能優(yōu)化微環(huán)境、去除體外培養(yǎng)環(huán)境中的毒素和代謝因子[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，以人羊膜上皮細(xì)胞(human amnion epithelial cells, hAECs)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞可向培養(yǎng)液分泌LIF，小鼠原始胚胎干細(xì)胞(prime embryonic stem cells)可在滋養(yǎng)層細(xì)胞hAECs和LIF、BMP- 4的作用下重編程為更原始的幼稚ESCs(naive embryonic stem cells)，并顯著提高Oct- 4、Sox2、FGF4和Nanog的表達(dá)水平[8]。以年輕患者的牙周韌帶干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，可通過細(xì)胞間相互作用逆轉(zhuǎn)老年患者的PDLSCs細(xì)胞的衰老現(xiàn)象，并能激活其細(xì)胞的多能性[9]。因此，細(xì)胞可能通過接觸和非接觸途徑提供其生長的微環(huán)境和信號，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、維持干細(xì)胞的性能、阻止分化[10]。

DPCs和DFCs是牙發(fā)育和再生的重要種子細(xì)胞，然而來源有限，加之其多能性和再生能力會隨體外傳代培養(yǎng)而消失，從而限制了其在口腔再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[1、11]。本課題組前期研究已證實，長期體外傳代培養(yǎng)的種子細(xì)胞多能性顯著降低，再生能力減弱，出現(xiàn)細(xì)胞老化[3]。然而，細(xì)胞老化是否可逆，可否模擬體內(nèi)微環(huán)境調(diào)控細(xì)胞多能性等問題仍然未得到解答。在體內(nèi)牙發(fā)育過程中，DPCs和DFCs相互接觸，相互作用，并在特定的微環(huán)境下生成了牙組織的特殊結(jié)構(gòu)[12]。為探討細(xì)胞交互作用與體外培養(yǎng)細(xì)胞生長、細(xì)胞老化的關(guān)系，本實驗通過建立DPCs和DFCs體外共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)牙發(fā)育的微環(huán)境，觀察細(xì)胞間交互作用對體外培養(yǎng)的DPCs和DFCs生長、衰老變化的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)共培養(yǎng)的DPCs和DFCs的細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組；培養(yǎng)至第7代時，共培養(yǎng)組的DPCs和DFCs的細(xì)胞衰老較對照組明顯降低。提示，該培養(yǎng)體系可促進(jìn)DPCs、DFCs的生長，并能抑制細(xì)胞衰老。

有研究表明，Oct- 4和Sox2可通過協(xié)同作用維持ESCs的多能性，當(dāng)其表達(dá)喪失時可導(dǎo)致細(xì)胞的多能性、分化能力及iPSCs克隆形成能力喪失[13]。Oct- 4/Sox2 復(fù)合體在ESCs重編程信號中處于核心地位，可啟動c- Myc、Klf4、FGF4 和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的多能性。因此Oct- 4、Sox2 和c- Myc與細(xì)胞多能性和重編程能力密切相關(guān)[14-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Oct- 4、Sox2 和c- Myc 均參與體內(nèi)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體和牙周附著的損傷修復(fù)，對牙髓和牙周韌帶組織損傷修復(fù)具有重要的調(diào)控作用[16]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)， DPCs/DFCs交互作用可調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)微環(huán)境，并能顯著提高內(nèi)源性O(shè)ct- 4、Sox2和c- Myc的表達(dá)、增強(qiáng)細(xì)胞的礦化能力； 提示，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境對維持DPCs傳代過程中的未分化性能有積極意義。

綜上所述，本實驗檢測了DPCs/DFCs交互作用對細(xì)胞生長、衰老、多能性因子表達(dá)和分化能力的調(diào)控作用，并證實DPCs/DFCs交互作用可促進(jìn)細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞衰老、提高多能性因子表達(dá)和細(xì)胞體外礦化能力； 提示細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境可調(diào)控細(xì)胞多能性。

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The effects of cell- cell interaction of dental papilla cells and dental follicle cells on cell pluripotency

LIU Lu, PENG Zheng- jun, WEI Xi, XU Zhe- zhen

(GuanghuaSchoolofStomatology,AffiliatedStomatologicalHospital,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofStomatology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510055,China)

AIM: To investigate the effect of cell- cell interaction of dental papilla cells (DPCs) and dental follicle cells (DFCs) on the pluripotency of the cells. METHODS: An in vitro cell- cell co- culture system of DPCs and DFCs was established. Cell growth, cell senescence and the expression of Oct- 4, Sox2 and c- Myc were investigated by cell counting, β- gal staining and immunohistochemical staining. The odontogenic differentiation capability of DPCs and DFCs was evaluated by ALP activity assay after 0, 7, 14, and 21 d of osteogenic induction. RESULTS: Under co- culture condition, cell growth of DPCs and DFCs was promoted, and cell senescence of DPCs and DFCs was inhibited. Expression of Oct- 4, Sox2 and c- Myc was significantly elevated in both cells on day 5 after coculture. ALP activity was significantly upregulated in both cells after 14d and 21d of odontogenic induction. CONCLUSION: Optimized microenvironment with cell- cell communication may enhance the pluripotency potential of DPCs and DFCs.

dental papilla cells (DPCs); dental follicle cells (DFCs); microenvironment; pluripotency

2014-08-29

國家自然科學(xué)基金資助項目(81400499) 高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120171120070)

劉路(1981-)，女，漢族，廣東惠州人。博士，副主任醫(yī)師

韋曦, E-mail: weixi@mail.sysu.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0063-05

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2012141)

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(11ykpy51)