劉慶娜, 吳補領(lǐng), 陳 婷 , 陳秋月, 賴玲芝

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院)

低氧預(yù)處理對人牙髓干細胞增殖和表達血管生成因子的影響

劉慶娜1,2, 吳補領(lǐng)1,2, 陳 婷1,2, 陳秋月1,2, 賴玲芝1,2

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院)

目的: 研究低氧預(yù)處理對人牙髓干細胞(hDPSCs)增殖及表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響。方法: 體外分離hDPSCs，按常氧組(210 mL/L O2)和低氧組(30 mL/L O2)分別培養(yǎng)，流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物；MTT檢測細胞增殖；Live/Dead 染色檢測細胞活性；qRT- PCR和ELISA檢測VEGF的表達量。結(jié)果： hDPSCs間充質(zhì)干細胞表面標志物 CD29、CD44、CD90表達為強陽性，而造血干細胞表面標志物CD34、CD45及內(nèi)皮細胞表面標志物CD31表達均為陰性；低氧組與常氧組均未發(fā)生細胞壞死現(xiàn)象；低氧組hDPSCs增殖能力和hDPSCs的VEGFmRNA表達量均顯著高于常氧組(P<0.05); 同時低氧組hDPSCs 培養(yǎng)上清中VEGF的濃度也顯著高于常氧組(P<0.05)；兩組hDPSCs的基質(zhì)細胞衍生因子(SDF- 1) mRNA表達量均隨時間的延長而增加，但低氧預(yù)處理對SDF- 1 mRNA的表達無顯著影響(P>0.05)。結(jié)論：低氧預(yù)處理對hDPSCs的細胞活性無明顯影響，并且可顯著促進hDPSCs的增殖及VEGF的表達。

人牙髓干細胞; 低氧預(yù)處理; 血管內(nèi)皮生長因子; 基質(zhì)細胞衍生因子

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):68]

人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)是存在于人牙髓組織中的一種間充質(zhì)干細胞，具備自我更新和多向分化潛能[1]。hDPSCs可從患者拔除的第三磨牙或正畸牙中分離培養(yǎng)獲得，由于其來源于自體細胞，可避免免疫排斥反應(yīng)[2]，因而成為牙髓再生研究最適合的種子細胞。

目前對hDPSCs的體外培養(yǎng)多采用常氧210 mL/L O2的氧體積分數(shù)，然而牙髓干細胞在體內(nèi)的微環(huán)境為低氧環(huán)境[3]。同時大量研究發(fā)現(xiàn)干細胞移植到體內(nèi)缺血缺氧組織后，多數(shù)細胞發(fā)生死亡，而低氧預(yù)處理可提高間充質(zhì)干細胞移植后的存活率，促進血管生成并顯著改善治療效果[4-7]。本實驗擬采用30 mL/L O2的低氧預(yù)處理hDPSCs，研究低氧預(yù)處理對hDPSCs增殖、細胞活性及表達血管生成相關(guān)因子VEGF、SDF- 1的影響，旨在為hDPSCs的體內(nèi)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)；I型膠原酶、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液 (Sigma，美國)；CD44、CD29、CD90、CD34、CD45、CD31熒光素標記鼠抗人抗體(Biolegend，美國)； 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；厭氧微需氧細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(ANOXOMAT MARK Ⅱ，荷蘭)；倒置光學顯微鏡(Olympus，日本)；流式細胞儀(BD，美國)； LightCycler 480 (Roche，瑞士)；PCR試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)；ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs的分離培養(yǎng)

收集臨床16～25歲因正畸或阻生需要拔除的健康完整恒牙，組織塊酶消化法[8]培養(yǎng)hDPSCs。待原代細胞長滿瓶底約80%時，常規(guī)傳代并擴大培養(yǎng)。

1.2.2 流式細胞儀檢測hDPSCs表面標記物

取第3代生長狀態(tài)良好的hDPSCs，2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心收集細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/mL，重懸于含有1 mg/mL BSA預(yù)冷的PBS，CD29、CD44、CD90、CD34、CD45、CD31抗體冰上避光孵育1 h，1 mg/mL BSA預(yù)冷的PBS清洗，上流式細胞儀檢測。

1.2.3 低氧培養(yǎng)hDPSCs

取第3～5代生長狀態(tài)良好的hDPSCs，接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，隨機分別放入低氧培養(yǎng)系統(tǒng)(30 mL/L O2)和普通二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(210 mL/L O2)中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)系統(tǒng)氧體積分數(shù)從210 mL/L O2降至30 mL/L O2，用時約2 min，當氧體積分數(shù)穩(wěn)定至30 mL/L O2后分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.2.4 MTT法檢測低氧對hDPSCs增殖的影響

取第3～5代人牙髓干細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(3×103/孔)，分常氧組和低氧組進行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d(每個時間點設(shè)6個復(fù)孔)后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使顆粒充分溶解，用酶標儀于490 nm 波長下測OD值。

1.2.5 細胞活性檢測(Live/Dead染色)

低氧和常氧分別培養(yǎng)hDPSCs 24、48、72 h后，去原培養(yǎng)液，加入PI/Calcein- AM混合熒光染色液，PI的終濃度為4 μmol/L，Calcein- AM的終濃度為2 μmol/L，37 ℃孵育15～30 min后，去除染色液，PBS洗滌細胞1～2次，倒置顯微鏡觀察(死細胞可被PI染為紅色，活細胞可被Calcein- AM染為黃綠色)。

1.2.6 qRT- PCR檢測低氧對hDPSCs表達血管生成相關(guān)因子的影響

采用Trizol法提取細胞總RNA，檢測總RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)條件為, 預(yù)變性：95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng): 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；溶解曲線分析: 95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0 s；降溫：40 ℃ 30 s。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 qRT- PCR各引物序列

1.2.7 ELISA檢測低氧對hDPSCs表達VEGF的影響

取常氧及低氧分別培養(yǎng)24、48、72 h后hDPSCs的上清液，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度(每個時間點設(shè)3個復(fù)孔)。ELISA檢測方法嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 軟件，對數(shù)據(jù)(均數(shù)±標準差)進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs的原代培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)約3～5 d后牙髓組織塊邊緣有細胞游出，多數(shù)細胞呈長梭形。約2～3 周可長滿瓶底80%，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，待細胞完全貼壁后，每3 d換液1次。平均3 d傳代1次，每次按1 ∶3傳代。隨著細胞生長密度的不斷增加，細胞呈放射狀或漩渦狀排列(圖1)。

2.2 hDPSCs表面標志物鑒定結(jié)果

流式細胞儀檢測所培養(yǎng)的細胞表面標志物，其中CD29、CD44、CD90(間充質(zhì)干細胞表面標志物)陽性表達率分別為99.97%、100%、99.92%；CD34、

CD45(造血干細胞表面標志物)陽性表達率分別為0.01%、0.47%；CD31(內(nèi)皮細胞表面標志物)陽性表達率為0.13%(圖2)。細胞間充質(zhì)干細胞表面標志物為陽性，造血干細胞表面標志物及內(nèi)皮細胞表面標志物為陰性，表明培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)來源干細胞。

a. hDPSCs原代培養(yǎng)第5天 b. 第3代hDPSCs

圖1 倒置顯微鏡觀察(×10)

圖2 流式細胞儀檢測細胞表面標記物

2.3 低氧預(yù)處理對hDPSCs增殖的影響

低氧培養(yǎng)2 d和3 d時hDPSCs的增殖活性明顯高于常氧組 (P<0.05)；4 d時，hDPSCs的增殖活性也高于常氧組，但無統(tǒng)計學差異(P=0.061)(圖3)。說明低氧培養(yǎng)一定時間可顯著促進hDPSCs的增殖。

圖3 低氧對hDPSCs增殖的影響(*P<0.05)

2.4 細胞活性檢測(Live/Dead染色)

Live/Dead染色結(jié)果可見，hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，低氧組細胞形態(tài)仍呈長梭形，與常氧組的細胞形態(tài)無差異，兩組細胞活性良好，均未發(fā)現(xiàn)細胞壞死的現(xiàn)象(圖4)。

2.5 低氧預(yù)處理對hDPSCs中VEGF、SDF- 1 mRNA表達的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各時間點低氧組hDPSCs中VEGF mRNA的表達量均明顯高于常氧組(P<0.05), 且48 h時VEGF mRNA的表達量增加最為顯著。兩組SDF- 1 mRNA表達量均隨時間延長而增加，但3個時間點低氧組與常氧組SDF- 1 mRNA的表達量無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

2.6 低氧預(yù)處理對hDPSCs中VEGF蛋白表達水平的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示：hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后。各時間點低氧組細胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度均高于常氧組。低氧組細胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度在48 h時略高于常氧組，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；24、72 h時，低氧組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度顯著高于常氧組(P<0.05)(圖6)。提示低氧預(yù)處理可顯著促進hDPSCs分泌合成VEGF。

a、b、c分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h； d、e、f分別為常氧培養(yǎng)24、48、72 h

圖5 低氧預(yù)處理對hDPSCs表達血管生成相關(guān)因子的影響(*與常氧組相比P<0.05)

*與常氧組相比P<0.05

3 討論

低氧是體內(nèi)普遍存在的一種生理病理現(xiàn)象，參與胚胎發(fā)育和多種病變的發(fā)展[9]。間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)存在的微環(huán)境為低氧環(huán)境[10-11]，牙髓干細胞作為間充質(zhì)干細胞，其在體內(nèi)的壁龕同樣是低氧環(huán)境[3]。但目前對牙髓干細胞的培養(yǎng)多采用常氧環(huán)境培養(yǎng)，這與其在體內(nèi)的存在環(huán)境有著較大的差異，因此采用低氧培養(yǎng)牙髓干細胞可更加真實模擬其體內(nèi)的生長環(huán)境，同時大量研究表明低氧預(yù)處理可提高間充質(zhì)干細胞移植后的存活率，因此研究低氧環(huán)境下牙髓干細胞的生物學特性具有重要的臨床意義。

本實驗采用30 mL/L O2對hDPSCs進行體外低氧預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)仍為長梭形，與常氧培養(yǎng)的細胞形態(tài)一致，未發(fā)生細胞死亡的現(xiàn)象，并且增殖能力顯著提高，與Iida等[12-14]的研究結(jié)果一致，說明短時間低氧預(yù)處理可促進hDPSCs的增殖。血管再生是牙髓再生的一個重要組成部分，而且血供的及時建立對于細胞移植后的存活有極為重要的意義。有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)hDPSCs可表達VEGF等血管生成相關(guān)因子，而VEGF在血管發(fā)生和形成過程中起著中樞性的調(diào)控作用，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、遷移、存活和分化為血管，是針對內(nèi)皮細胞特異性最高，促血管生長作用最強的有絲分裂原[17]; 本實驗與上述研究結(jié)果一致。此外，實驗還對常氧及低氧培養(yǎng)的hDPSCs表達SDF- 1進行了檢測，發(fā)現(xiàn)hDPSCs同樣可表達SDF- 1。SDF- 1是小分子的細胞因子，屬于趨化因子蛋白家族，其在促進內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮祖細胞的動員、歸巢和新生血管形成等過程中有著重要的調(diào)節(jié)作用。

實驗在進一步證實hDPSCs可表達血管生成相關(guān)因子VEGF及SDF- 1的基礎(chǔ)上，比較了不同時間點低氧和常氧培養(yǎng)的hDPSCs表達血管生成相關(guān)因子的差異，發(fā)現(xiàn)低氧可顯著促進其表達VEGF。低氧48 h時VEGF mRNA表達增加最為顯著，低氧24、72 h時其表達與常氧培養(yǎng)較接近，ELISA結(jié)果也顯示低氧培養(yǎng)的hDPSCs培養(yǎng)上清中VEGF的濃度顯著高于常氧組，但不同時間點VEGF的表達在mRNA水平與蛋白水平存在一定差異，推測可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。SDF- 1 mRNA的表達隨時間延長不斷增加，但低氧對其表達無明顯影響，這與之前的研究結(jié)果有所不同，Gong等[14]采用10 mL/L O2培養(yǎng)牙髓細胞24 h后發(fā)現(xiàn)低氧可下調(diào)SDF- 1的表達，其原因可能是低氧培養(yǎng)的氧濃度不同及低氧培養(yǎng)的時間不一致引起的。

本結(jié)果顯示低氧可顯著促進VEGF的表達，而大量研究表明VEGF與間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)外促血管生成潛能有著密切關(guān)系。Liu等[18]采用低氧預(yù)處理脂肪干細胞后，血管生長因子VEGF和bFGF表達增加，將細胞上清液培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞后，其在基質(zhì)膠上形成的毛細血管樣結(jié)構(gòu)顯著多于常氧組；Yu等[4]將低氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細胞移植到肝切除術(shù)的動物模型上后，發(fā)現(xiàn)可促進肝再生，其機制可能是低氧預(yù)處理促進了骨髓干細胞表達VEGF。以上結(jié)果均表明低氧預(yù)處理可通過促進間充質(zhì)干細胞表達VEGF來增強其成血管潛能。因此推測低氧預(yù)處理同樣可通過促進hDPSCs表達 VEGF增強其促血管生成潛能，但對這一推測的驗證，還需要進一步的體外共培養(yǎng)實驗及體內(nèi)移植實驗等。

綜上所述，體外低氧培養(yǎng)hDPSCs可顯著促進細胞增殖及VEGF的表達，雖然其機制的闡明還需進一步的研究，但提示低氧預(yù)處理對hDPSCs的體內(nèi)移植可能是有利的。

[1]Gronthos S, Mankani M, Brahim J,etal. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000, 97(25): 13625-13630.

[2]Mitsiadis TA, Feki A, Papaccio G,etal. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury [J].AdvDentRes, 2011, 23(3): 275-279.

[3]Yu CY, Boyd NM, Cringle SJ,etal. Oxygen distribution and consumption in rat lower incisor pulp [J].ArchOralBiol, 2002, 47(7): 529-536.

[4]Yu J, Yin S, Zhang W,etal. Hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells promote liver regeneration in a rat massive hepatectomy model [J].StemCellResTher, 2013, 4(4): 83.

[5]Leroux L, Descamps B, Tojais NF,etal. Hypoxia preconditioned mesenchymal stem cells improve vascular and skeletal muscle fiber regeneration after ischemia through a Wnt4-dependent pathway [J].MolTher, 2010, 18(8): 1545-1552.

[6]Yue Y, Zhang P, Liu D,etal. Hypoxia preconditioning enhances the viability of ADSCs to increase the survival rate of ischemic skin flaps in rats [J].AestheticPlastSurg, 2013, 37(1): 159-170.

[7]Yu X, Lu C, Liu H,etal. Hypoxic preconditioning with cobalt of bone marrow mesenchymal stem cells improves cell migration and enhances therapy for treatment of ischemic acute kidney injury [J].PLoSOne, 2013, 8(5): e62703.

[8]盧婧，唐榮銀，李彥. 人牙髓細胞原代培養(yǎng)方法的比較研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2006, 16(6): 311-313.

[9]龔啟梅. 低氧對成體干細胞增殖和分化的影響[J]. 國際口腔醫(yī)學雜志, 2011, 38(6): 696-699.

[10]Mohyeldin A, Garzon- Muvdi T, Quinones- Hinojosa A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche [J].CellStemCell, 2010, 7(2): 150-161.

[11]Jing D, Wobus M, Poitz DM,etal. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro [J].Haematologica, 2012, 97(3): 331-339.

[12]Iida K, Takeda- Kawaguchi T, Tezuka Y,etal. Hypoxia enhances colony formation and proliferation but inhibits differentiation of human dental pulp cells [J].ArchOralBiol, 2010, 55(9): 648-654.

[13]Sakdee JB, White RR, Pagonis TC,etal. Hypoxia- amplified proliferation of human dental pulp cells [J].JEndod, 2009, 35(6): 818-823.

[14]Gong QM, Quan JJ, Jiang HW,etal. Regulation of the stromal cell- derived factor- 1alpha- CXCR4 axis in human dental pulp cells [J].JEndod, 2010, 36(9): 1499-1503.

[15]Bronckaers A, Hilkens P, Fanton Y,etal. Angiogenic properties of human dental pulp stem cells [J].PlosOne, 2013, 8(8): e71104.

[16]馮毅，馬靜，黃貞. 牙髓干細胞促進牙髓血管生成的相關(guān)分子機制研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2013, 23(12): 768-772.

[17]Ribatti D. The crucial role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in angiogenesis: a historical review [J].BrJHaematol, 2005,128(3):303-309.

[18]Liu L, Gao J, Yuan Y,etal. Hypoxia preconditioned human adipose derived mesenchymal stem cells enhance angiogenic potential via secretion of increased VEGF and bFGF [J].CellBiolInt, 2013, 37(6): 551-560.

Effect of hypoxia preconditioning on the proliferation and angiogenic factor expression of human dental pulp stem cells

LIU Qing- na*, WU Bu- ling, CHEN Ting, CHEN Qiu- yue, LAI Ling- zhi

(*NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

AIM: To investigate the effects of hypoxia preconditioning on the proliferation and VEGF expression of human dental pulp stem cells (hDPSCs). METHODS: hDPSCs were cultured under normoxia (210 mL/L O2) and hypoxia (30 mL/L O2) respectively for 72 h. Cell surface molecules were examined by flow cytometry. MTT method was used to observe cell proliferation and Live/Dead assay was used to observe the cell viability, qRT- PCR and ELISA were performed to measure the expression of VEGF and SDF- 1. RESULTS: Strong positive expression of CD29, CD44 and CD90 was found in hDPSCs. CD34, CD45 and CD31 were negative in the cells. Dead cell was not found in both groups. hDPSCs in hypoxia group showed higher proliferation ability than that in normoxia group(P<0.05). Hypoxia significantly increased VEGF mRNA and protein expression (P<0.05), but showed no significant effect on SDF- 1 mRNA expression. CONCLUSION: Hypoxia preconditioning has no influence on hDPSCs viability, but can promote the proliferation and VEGF expression of hDPSCs.

human dental pulp stem cells(hDPSCs); hypoxia preconditioning; VEGF; SDF- 1

2014-09-22;

2015-01-20

國家自然科學基金資助項目(81371137)

劉慶娜(1987-)，女，漢族，河南安陽人。碩士生(導(dǎo)師：吳補領(lǐng))

吳補領(lǐng)，E-mail: bulingwu@smu.edu.com

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0068-05