賴玲芝, 吳補領(lǐng), 徐會勇, 陳秋月, 劉慶娜

(1. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院, 廣東 廣州 510515)

周期性張應(yīng)力對人牙周膜細胞Periostin表達的影響

賴玲芝1,2, 吳補領(lǐng)1,2, 徐會勇1,2, 陳秋月1,2, 劉慶娜1,2

(1. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院, 廣東 廣州 510515)

目的: 研究在機械力作用下人牙周膜細胞(hPDLCs)內(nèi)Periositn(PN)mRNA和蛋白的表達變化。方法: 采用組織塊酶消化法培養(yǎng)hPDLCs，經(jīng)鑒定后將第4代細胞隨機分為4個實驗組和1個對照組(非加力組)，4個實驗組分別采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對hPDLCs加載6、12、24、48 h的周期性張應(yīng)力；然后采用qRT- PCR、Western blot分別檢測各組hPDLCs中PN mRNA和蛋白的表達變化。結(jié)果: 在正常hPDLCs中表達PN mRNA和蛋白；與對照組相比，加力6 h后，PN mRNA和蛋白的表達水平均明顯降低(P<0.05)；加力12 h后，PN mRNA和蛋白的表達均逐漸升高，并持續(xù)至24 h達最高水平(P<0.05)；而在加力48 h時，PN mRNA和蛋白表達均明顯下降，并恢復(fù)至對照組的表達水平(P>0.05)。結(jié)論: 機械力可誘導(dǎo)hPDLCs中PN的表達增強及活化，且具有時間依賴性；提示PN可能參與了細胞內(nèi)生物力學信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

周期性張應(yīng)力; 人牙周膜細胞(hPDLCs); periositn; 牙周組織改建

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):79]

通過機械力啟動牙周膜細胞的生理反應(yīng)是正畸牙齒移動的直接原因，而細胞外基質(zhì)的改建則是正畸牙齒移動的基礎(chǔ) 。牙周膜細胞作為矯治力的直接效應(yīng)細胞，當其受到機械應(yīng)力作用時，會發(fā)生形態(tài)和功能狀態(tài)的變化，并可通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對機械力做出反應(yīng),從而引發(fā)一系列細胞生物學反應(yīng)[1-3]；在此過程中，不僅合成人牙周膜細胞外基質(zhì)中大多數(shù)的各型膠原纖維和蛋白多糖，而且還通過分泌和合成多種多樣的細胞因子與酶共同參與調(diào)節(jié)牙周組織的代謝和改建。

Periositn(PN)是新發(fā)現(xiàn)的一種多功能的細胞外基質(zhì)蛋白，在骨膜和牙周膜中特異性表達，屬成束蛋白( fasciclin) 家族成員，分子量為90 kD。近年來的一系列體內(nèi)和體外研究表明，PN可促進纖維的分化和成熟，在維護牙周組織的完整性、牙齒的發(fā)育、萌出以及機械應(yīng)激導(dǎo)致的組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要的作用，被認為是一種對牙周膜穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的細胞外基質(zhì)蛋白[4]；并推測其可能對正畸牙移動中牙周組織的改建也起著關(guān)鍵的作用。目前PN僅僅限于嚙齒類動物的牙和牙周組織的體內(nèi)外試驗性研究，但從體外細胞基因和蛋白水平研究正畸牙齒移動過程中人牙周膜細胞(hPDLCs)中PN的表達變化尚未見報道。

本實驗采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞加載周期性張應(yīng)力，以模擬正畸牙齒移動過程中的施力方式，并通過qRT- PCR和Western blot測定機械張應(yīng)力對hPDLCs中PN表達的影響，為進一步系統(tǒng)性探討機械力作用下牙周組織改建的分子生物學機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L 胰酶(Gibco 公司，美國)；胎牛血清(Corning 公司，美國)；Trizol逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒(Takara公司,日本)；羊抗人、鼠多克隆PN抗體(Abcam公司，美國)；PVDF膜(Millipore, 德國)；Flexcell 5000XT 細胞力學裝置(Flexcell公司，美國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；羅氏480熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)；電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀制膠器(Amersham Biosciences公司，美國)。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 hPDLCs的分離和培養(yǎng)

取12～18歲志愿者因正畸減數(shù)而新鮮拔除的牙周組織健康的前磨牙，立即置于含雙抗(青、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液中，并用含雙抗的PBS沖洗3遍；然后在無菌濕潤條件下刮取根中1/3的牙周膜組織，用PBS沖洗并離心后加入200μLⅠ型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min；終止消化并離心后，將組織塊平整置于6孔板中，上蓋無菌蓋玻片，每孔加入2 mL含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。次日首次換液，以后每3 d換液1次，并用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況；待細胞從組織塊中爬出并鋪滿瓶底達80%時進行首次傳代。

1.2.2 hPDLCs的鑒定

取第3代hPDLCs經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，采用常規(guī)ABC免疫細胞化學染色法分別進行波形絲蛋白(Vmentin)、角蛋白 (Cytokeratin)染色，倒置相差顯微鏡下觀察免疫組織化學染色結(jié)果，并判斷是否符合中胚層來源的成纖維細胞樣細胞的特征[5-7]。鑒定正確后，取第4～6代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞張應(yīng)力加載

取生長狀況良好的hPDLCs，以5×105/mL 的密度接種于包被I型膠原的BioFlex 6孔板彈性基底膜內(nèi)，為使細胞同步化，在細胞繼續(xù)生長密度達到80%時，更換含20 mL/L FBS為DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，將細胞隨機分為4個實驗組和1個對照組，4個實驗組采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)分別加載6、12、24、48 h；對照組不加力，在相同條件下靜態(tài)培養(yǎng)。力學刺激滿足形變率為10%，頻率為0.5 Hz，波形為正弦波[8]。

1.4 qRT- PCR檢測機械張應(yīng)力作用下PN mRNA的表達

應(yīng)力加載結(jié)束后，用Trizol法提取各組細胞的總RNA，并用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，用SYBR Select Master Mix試劑盒和羅氏480熒光定量PCR儀進行qRT- PCR檢測；所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，具體序列見表1；反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。利用羅氏480熒光定量PCR System聯(lián)機軟件進行Ct值相對定量分析，分別計算各組PN mRNA相對表達量。每組3個平行孔，實驗重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.5 Western blot檢測周期性張應(yīng)力作用下PN蛋白的表達

取應(yīng)力加載結(jié)束后的各組細胞，分別在其BioFlex 6孔板的各孔中各加250 μL含PMSF的裂解液裂解細胞；細胞裂解后離心取上清液，加入20 μL 2×SDS 上樣緩沖液混勻，煮沸3～5 min后離心取上清進行 SDS- PAGE蛋白電泳。電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并將其放入平皿中；加入封閉液搖動封閉1 h后，再加入用封閉液稀釋的一抗(1 ∶500)搖動孵育1 h，并4 ℃過夜；分別用PBS洗膜3次(每次5～10 min)、TBS洗膜1次(每次5～10 min)后，加入TBS配制的10 g/L脫脂奶粉溶液稀釋的二抗(1 ∶1000)，37 ℃搖動反應(yīng) 1～2 h；再次用TBS洗膜3次(每次5～10 min)后用電化學發(fā)光顯色劑進行顯色，暗室下曝光顯影，并用Quanlity one分析軟件對條帶灰度值進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所得結(jié)果經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析對總體進行比較，若方差齊，組間兩兩比較用LSD檢驗；若方差不齊，則選用Dunnett's T3檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

2.1.1 hPDLCs形態(tài)學觀察

組織塊酶消化法連續(xù)培養(yǎng)5～10 d時，可見細胞從組織塊中游出，并以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長，有時互相連接成網(wǎng)狀；細胞均呈長梭形或星形，核為圓形或橢圓形，位于細胞中央，細胞透明度大，折光性強，輪廓不清(圖1)。 傳代擴大培養(yǎng)后，細胞貼壁性能良好，并可穩(wěn)定傳代(圖 2)。

2.1.2 細胞來源鑒定結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示：細胞抗波形絲蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)棕黃色，陽性顆粒分布均勻，胞核清晰無染色(圖3)；而抗角蛋白染色陰性(圖4)。表明所培養(yǎng)的細胞符合中胚層來源的成纖維細胞樣細胞的特征。

圖1 hPDLCs原代培養(yǎng)第7天(×100)圖2 第3代hPDLCs(×40)圖3 抗波形蛋白陽性染色圖(×100)圖4抗角蛋白陰性染色圖(×100)

2.2 加力不同時間對hPDLCs PN mRNA表達的影響

在正常hPDLCs內(nèi)表達PN，加載張應(yīng)力6 h后，PN表達降低，而加力12 h后，PN表達開始增強，并持續(xù)增強至加力24 h達最高峰，加力48 h后開始減弱；其中加力6 h和24 h組分別與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加力12 h和48 h組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5)。

2.3 加力不同時間對hPDLCs PN蛋白表達的影響

經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示，各組PN蛋白的表達與mRNA的表達變化一致，即在正常hPDLCs中有PN蛋白的表達，與之相比，PN蛋白的表達在細胞加載張應(yīng)力6 h時，明顯降低(P<0.05); 加力到12 h后開始升高并達到對照組水平(P<0.05)；加力24 h時，達到最高(P<0.05)；而在加力48 h時開始下降，恢復(fù)至對照組的表達水平(P>0.05)(圖6)。

圖5 加力不同時間點hPDLCs PN mRNA的表達變化

圖6 加力不同時間點hPDLCs PN蛋白的表達變化

3 討論

本結(jié)果顯示，hPDLCs中的PN基因和蛋白表達水平在應(yīng)力作用下有明顯的變化，并具有時間相關(guān)性。但是，由于hPDLCs在口腔內(nèi)處在復(fù)雜的力學環(huán)境中，使得實驗條件不易控制，無法從單一因素來研究力學刺激對hPDLCs的結(jié)構(gòu)、功能的影響。因此，應(yīng)用體外細胞加力裝置，研究細胞如何精確地控制并模擬生物牽張力對細胞增殖、分化及凋亡的影響越來越受到國內(nèi)外學者的關(guān)注。目前廣泛應(yīng)用的力學模型有：離心力加載裝置[9]、流體剪切力加載裝置[10]、基底形變加載裝置[11]等，其中基底形變加載裝置產(chǎn)生的主要是牽張力，與牙周膜細胞在口腔內(nèi)主要受牽張力的影響基本一致[12]。所以本實驗采用目前應(yīng)用最廣泛、最理想的Flexcell 5000XT 體外細胞拉伸加力裝置[13]，以模擬正畸牙移動過程中的方式；并探討機械張應(yīng)力對hPDLCs 表達PN的影響。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，周期性張應(yīng)力刺激6 h組的 hPDLCs中 PN的mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯減弱，但在加力12 h后，兩者的表達均出現(xiàn)回升。提示，在應(yīng)力作用的早期階段，受力細胞可能對應(yīng)力刺激做出了保護性反應(yīng)；隨著加力時間的延長，細胞逐漸適應(yīng)了應(yīng)力的作用并隨之做出積極的反應(yīng)，同時也說明hPDLCs對張應(yīng)力的適應(yīng)較快。加力24 h后，hPDLCs 中的PN mRNA和蛋白的表達水平均達到最高峰(P<0.05)；而在加力48 h 時，兩者的表達均有所下降，并恢復(fù)至對照組的表達水平(P>0.05)，表明在周期性張應(yīng)力作用下，適宜的加力時間可促進PN的表達，但過長的時間會降低PN的表達。該結(jié)果與Wilde等[14]的研究結(jié)果一致，Wilde等對7周齡雄性SD大鼠進行實驗性牙移動，并在加力后不同時間點測量其牙周膜中PN mRNA的表達；結(jié)果顯示，加力24 h后PN mRNA的表達最強，牙齒移168 h后PDL中PN mRNA的表達表現(xiàn)出與對照類似的分布。Wen等[8]在研究TGF- β1和FAK對Periostin在牙周成纖維細胞中表達的調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)，當單軸應(yīng)力循環(huán)加載于牙周成纖維細胞48 h后，其Periostin的mRNA表達水平高于加力24 h組，與本結(jié)果有所不同。分析原因可能與加力方式不一致有關(guān)，加之Wen等的實驗僅設(shè)計兩個加力時間點和一個基因水平檢測指標；而本實驗設(shè)計了4個時間點，并分別從基因水平和蛋白水平同時分析hPDLCs 內(nèi)PN的表達，更具有代表性。近年來已有不少學者研究了機械力對牙周膜細胞表達PN的影響，Rios等[15]報道，人工誘導(dǎo)的大鼠咬合功能減退，可使其牙周膜細胞中的PN mRNA會出現(xiàn)暫時性的表達降低。fanador等[16]發(fā)現(xiàn)，小鼠右下頜磨牙的咬合功能減退后，其牙周膜細胞中的PN表達水平明顯下降。Iekushi等[17]發(fā)現(xiàn)，機械力牽拉心肌細胞和成纖維細胞均可使骨膜蛋白的表達上調(diào)。以上研究均表明，PN是力學敏感的一種細胞因子，并高表達于牙周組織。雖然上述研究的對象、方法、結(jié)果不盡相同，但PN在hPDLCs中的表達均在應(yīng)力作用下發(fā)生了變化，提示PN可能在正畸牙移動時的牙周組織改建過程中發(fā)揮積極的作用。

現(xiàn)在 PN與TGF- β1的關(guān)系越來越受各界的關(guān)注，多項研究表明PN參與多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，且其表達與 TGF- β1密切相關(guān)。PN作為TGF- β1的下游因子，具有趨化心肌纖維細胞、促進膠原的合成和成熟的作用；并可促進形成穩(wěn)定的膠原網(wǎng)而參與膠原重構(gòu)[18]。PN蛋白參與反饋機制主要通過TGF- β1信號系統(tǒng)刺激，由αv-整聯(lián)蛋白陽性的成纖維細胞表達，生成的PN蛋白能夠進一步增加纖維細胞的移動性、收縮性及其合成基質(zhì)蛋白的能力；PN在這一反饋機制中成為板機點。但TGF- β1信號相關(guān)通路是否也介導(dǎo)了正畸牙移動中PN對牙周膜改建的作用尚不清楚，有待進一步研究。

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Expression of Periositn mRNA and protein in cultured human periodontal ligament cells after cyclic stretch

LAI Ling- zhi*, WU Bu- ling, XU Hui- yong, CHEN Qiu- yue, LIU Qing- na

(*Dept.ofStomatology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

AIM: To observe the effects of cyclic stretch on the expression of periositn(PN) in human periodontal ligament cells(hPDLCs). METHODS: Primary hPDLCs were cultured by tissue block enzymolytic method. Cells were subjected to cyclic stretch by Flexcell FX- 5000T system at 0.5 Hz of 10% elongation for 6, 12, 24 and 48 hours respectively. The mRNA and protein expression of PN were measured by qRT- PCR and western blot respectively. RESULTS: PN mRNA and protein were positively expressed in control hPDLCs. PN mRNA and protein were decreased after 6- hour cyclic stretch, then increased after 12- hour cyclic stretch and reached to the highest level after 24- hour treatment(P<0.05). After 48 hour treatment, PN expression began to decline, consistent with the expression level of the control cells. CONCLUSION: Cyclic stretch may change the expression level of PN in hPDLCs in a time- dependent manner. PN may plays an important role in cell signal transduction of mechanical strain.

cyclic stretch; human periodontal ligament cells(hPDLCs); periositn(PN); periodontal tissue remodeling

2014-08-13

廣東省高等學校人才引進科研資助項目(C1030270)

賴玲芝(1985-)，女，漢族，廣東人。碩士生(導(dǎo)師： 吳補領(lǐng))

吳補領(lǐng)，E-mail：bulingwu0605@yahoo.com

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0079-05