鄭甲林 郭 濤 張新金 陶四明 代華磊 韓明華 李建美

(昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南 昆明 650021)

Harary等〔1〕首次嘗試Wistar乳鼠心肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)。然而，到目前為止研究心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法更多集中在心室肌細(xì)胞培養(yǎng)或心室肌與心房肌細(xì)胞混合培養(yǎng)，且多選擇乳鼠作為研究對象。關(guān)于單一心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)研究相對較少，局限于左心房的心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)未見報(bào)道。本文對以往心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法學(xué)習(xí)總結(jié)，成功分離、純化、培養(yǎng)并鑒定出了乳兔單一左心房肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1動物、試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 日本大耳乳兔，出生48 h內(nèi)，雌雄不限，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室中心提供。胎牛血清(Hyclone公司)，高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS、自配)，胰蛋白酶(Difco)，Ⅱ型膠原酶(Invitrogen)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100、Amresco)，組織固定液(多聚甲醛，Sigma)，封閉專用脫脂奶粉(BSA、北京 Applygen公司)，0.4%臺盼藍(lán)(Trypan Blue，Sigma公司)，一抗為α-橫紋肌肌動蛋白抗體小鼠抗兔(α-Sarcomeric actin Antibody，Santa Cruz公司)，二抗為羊抗小鼠IgG-FITC熒光標(biāo)記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標(biāo)記(武漢博士德生物有限公司);4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司);青鏈霉素雙抗(hyclone公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純;細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(美國BD Falcon);恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國 New Brunswick Scientific Innova CO-170 CO2incubator);生物安全柜(美國Thermo Electron Corporation forma classⅡA2);倒置顯微鏡(日本Olympus IX51);離心機(jī)(中國京立LDZ5-2);恒溫磁力攪拌器(韓國WiseStir MSH-20D);恒溫振蕩水浴箱(北京恒久科學(xué)儀器廠)。

1.2乳兔左心房肌細(xì)胞培養(yǎng)及純化 借鑒Bénardeau等〔2〕心房肌細(xì)胞培養(yǎng)方法并加以改良。同時(shí)取10只出生48 h內(nèi)的日本大耳乳兔，斷頸處死，75%酒精全身消毒后，在生物安全柜內(nèi)，消毒眼科剪剪開胸骨，迅速剪下心臟并置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中多次清洗、去血，用眼科剪在手術(shù)用放大鏡下仔細(xì)剪下左心房(含房間隔)，再次用PBS液多次清洗、去血致組織塊變白，在PBS液中用眼科剪將左心房及房間隔剪成直徑約1 mm3大小的組織塊。用吸管將1 mm3的組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.1%胰酶，37℃水浴10 min，反復(fù)輕柔吹打，棄上清液。將組織塊液全部轉(zhuǎn)移至直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，再加入預(yù)配0.1%胰酶、0.1%Ⅱ型膠原酶混合酶液5 ml，將組織塊盡量吹分散，培養(yǎng)皿中放入預(yù)先消毒的磁力攪拌子，將培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，剩余組織再加入0.1%胰酶、0.1%Ⅱ型膠原酶混合酶液5 ml，將培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，參數(shù)設(shè)置同上，重復(fù)消化，并留取上清液，直至組織塊完全消化。每次吸取的上清液加入容積為10 ml離心管中，再加入等體積的杜爾伯科改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗)終止消化。收集所有的組織消化液離心，800 r/min，5 min，用吸管小心吸取上清液棄之，沉淀的細(xì)胞加入適量DMEM培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)輕柔吹打，制成細(xì)胞懸液。在細(xì)胞懸液中加入1滴無菌的1 mg/ml溶于水的DNA酶，防止消化的細(xì)胞粘連成團(tuán)塊。用200目消毒不銹鋼網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置入恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)60 min后，平穩(wěn)取出培養(yǎng)皿，用吸管小心吸取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，用2次差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞懸液為1×105個(gè)/ml，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶面積25 cm2)。最初的2 d在培養(yǎng)瓶中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)抑制非心肌細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)生長，每1 ml培養(yǎng)基中加入10 mmol/L的5-BrdU 10 μl即得到5-BrdU終濃度0.1 mmol/L。置入恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每2天換培養(yǎng)基一次。

細(xì)胞傳代方法:單層細(xì)胞貼壁鋪滿培養(yǎng)瓶底的80% ～90%時(shí)進(jìn)行傳代。用吸管小心吸取原代細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液棄之，加入PBS反復(fù)輕柔清洗細(xì)胞，棄PBS后加0.1%胰酶2 ml，鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞由片狀收縮呈球形時(shí)，迅速加入DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁，使細(xì)胞與瓶壁分離脫落，以1∶2分裝接種。細(xì)胞接近長滿瓶底后(約4～6 d)可再傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定與實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞爬片制備:將第2代鋪滿培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞同上步驟，制成細(xì)胞懸液滴加在放置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加樣3 ml，置入恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)，以后每2天換培養(yǎng)基一次。

1.3心房肌細(xì)胞生長、形態(tài)觀察 每次消化后取0.5 ml細(xì)胞懸液于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡(200倍)下觀察心房肌細(xì)胞貼壁情況、生長狀況、形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞搏動時(shí)間及頻率，并照相。并從培養(yǎng)24 h至第7天，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞搏動頻率(次/min)。

1.4酶消化后細(xì)胞存活率計(jì)算 經(jīng)酶消化后，細(xì)胞接種前計(jì)數(shù)存活率。取吹打均勻的細(xì)胞懸液2 ml，與0.4%臺盼藍(lán)液5 ml、PBS液3 ml混合吹打均勻制成細(xì)胞懸液，于室溫下靜置5 min，使其充分染色，吸取少量混合細(xì)胞懸液于倒置顯微鏡下觀察，鑒定消化后的細(xì)胞存活率。正常細(xì)胞不被染色，顯微鏡下為透明、折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色。在顯微鏡(200倍)下計(jì)數(shù)4個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù)及著色細(xì)胞數(shù)，每次計(jì)數(shù)3次，求平均值，重復(fù)3次。細(xì)胞成活率(%)=〔(總細(xì)胞數(shù)－著色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%〕。

1.5繪制細(xì)胞生長曲線 采用計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線(計(jì)數(shù)方法同上)。選擇生長良好且接近融合的第2代細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，用上述相同方法在新的培養(yǎng)基上制成細(xì)胞懸液。接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔5×104個(gè)/ml做傳代培養(yǎng)，共接種21孔細(xì)胞。置入恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)。24 h后開始計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，之后每隔24 h計(jì)數(shù)一次，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，每次取3孔細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。分別以時(shí)間(d)、單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml)為橫、縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算細(xì)胞群體的倍增時(shí)間(Td)，Td=t×lg2/1gNt－lgNo，其中 t代表計(jì)數(shù)間隔時(shí)間或稱培養(yǎng)時(shí)間，No代表接種后的細(xì)胞數(shù)，Nt代表對數(shù)生長期任一點(diǎn)的理論觀察值(即培養(yǎng)t h后的細(xì)胞數(shù))。

1.6心房肌細(xì)胞免疫熒光及純度鑒定 采用間接免疫熒光鑒定法。培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次，5 min/次;用4%的多聚甲醛，室溫下固定30 min，PBS洗滌3次，5 min/次;細(xì)胞爬片上加0.5%TritonX-100對細(xì)胞進(jìn)行打孔5 min，吸去打孔通透液，PBS洗滌3次，5 min/次;0.1%BSA室溫封閉30 min，加一抗小鼠抗兔α-橫紋肌肌動蛋白抗體(1∶50稀釋)4℃ 過夜;PBS洗滌3次，5 min/次;加二抗為羊抗小鼠 IgGFITC熒光標(biāo)記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標(biāo)記(1∶100稀釋)，室溫90 min，PBS洗滌3次，5 min/次。加入抗熒光淬滅液封片。DAPI染色細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察并照相，設(shè)立對照組(不加一抗，只加二抗)。于顯微鏡下(200倍)任選10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陰性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)數(shù)3次，求平均值，陽性細(xì)胞率=細(xì)胞總數(shù)－陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1心房肌細(xì)胞鏡下觀察 每次消化后取0.5 ml細(xì)胞懸液于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中，于倒置顯微鏡下觀察，可見心房肌細(xì)胞呈圓形或橢圓形。首次消化細(xì)胞量少，第2、3次消化細(xì)胞量較多，經(jīng)3次后多可完全消化組織。收集所有的組織消化液經(jīng)兩次差速貼壁后將細(xì)胞懸液接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，倒置顯微鏡下可見單個(gè)細(xì)胞散在懸浮于培養(yǎng)基中，大多數(shù)細(xì)胞呈圓形或橢圓形;2～3 h后可見少量細(xì)胞貼壁，仍以圓形與橢圓形為主，可見少量細(xì)胞呈多邊形;接種16～24 h后細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞為長梭形、三角形、多邊形或不規(guī)則形，可見單個(gè)搏動細(xì)胞，頻率較慢;培養(yǎng)48 h部分細(xì)胞融合在一起;培養(yǎng)72 h細(xì)胞為多邊形、不規(guī)則形，大部分細(xì)胞間相互連接，搏動趨于同步;培養(yǎng)4 d后細(xì)胞達(dá)瓶底70%，相互連接在一起成簇，搏動基本同步，搏動頻率加快，50～101次/min;培養(yǎng)7 d后細(xì)胞達(dá)瓶底80%～90%或以上，偽足相互交織成網(wǎng)，融合呈同心圓放射狀排列，呈現(xiàn)同步搏動，心房肌細(xì)胞有一定收縮力。見圖1。

2.2肌細(xì)胞存活率 經(jīng)臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，測得細(xì)胞存活率平均為85.2%。其中實(shí)驗(yàn)1次細(xì)胞存活率為81.3%，實(shí)驗(yàn)2次為87.8%，3次為86.6%。

2.3心房肌細(xì)胞生長曲線 第3代心房肌細(xì)胞1～4×106/ml呈對數(shù)生長，倍增時(shí)間約24 h(見圖2)。

圖1 鏡下觀察心房肌細(xì)胞(×200)

2.4心房肌細(xì)胞純度鑒定 用特異性小鼠抗兔α-橫紋肌肌動蛋白抗體(一抗)、羊抗小鼠IgG-FITC熒光標(biāo)記及羊抗小鼠IgG-Cy3熒光標(biāo)記(二抗)心房肌細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞質(zhì)為綠色及紅色熒光，DAPI襯染細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為心房肌細(xì)胞，陽性率達(dá)95%。見圖3。

圖2 第3代心房肌細(xì)胞生長曲線

圖3 心房肌細(xì)胞純度鑒定(×400)

3討論

目前原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法是將組織剪切成小塊后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，此方法操作簡單，但獲得的細(xì)胞數(shù)量少。酶消化培養(yǎng)法是將取下的組織剪碎后，在單獨(dú)胰酶或者膠原酶，或胰酶加膠原酶〔3，4〕的作用下去除細(xì)胞外基質(zhì)使細(xì)胞游離。胰酶可分解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，同時(shí)對細(xì)胞膜有較強(qiáng)的破壞，組織細(xì)胞破壞作用很強(qiáng)，經(jīng)胰酶消化后的組織會釋放大量的膠原蛋白，大量膠原蛋白易形成絮狀物，使消化后細(xì)胞和上清液很難分離開，影響心肌細(xì)胞分離;膠原酶可分解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維，作用相對弱。此方法分離的細(xì)胞易于從培養(yǎng)基中獲取營養(yǎng)，可以快速獲得大量的細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞的效率高，較常用。

心臟細(xì)胞主要由心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成，研究報(bào)道心肌細(xì)胞數(shù)占心臟細(xì)胞總數(shù)不一(30% ～60%)。培養(yǎng)出單一的心房肌細(xì)胞為進(jìn)一步研究心房肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、離子通道、蛋白表達(dá)改變，藥物干預(yù)及相關(guān)電生理變化提供平臺〔5〕，以及可進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因、膜片鉗等先進(jìn)技術(shù)研究心臟疾病〔6，7〕。心房顫動(房顫)是一種最常見的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的心律失常疾病，房顫的發(fā)生與左心房病變聯(lián)系非常緊密，分離培養(yǎng)單一左心房肌細(xì)胞尤為重要。心房肌較心室肌薄，心房肌占整個(gè)心臟的比重很小，乳鼠、乳兔心臟體積很小，而心房體積則約1～2 mm3，取材很困難，再加上消化過程中酶損傷、機(jī)械損傷、非心房肌細(xì)胞干擾等因素，大大減少可獲得的細(xì)胞數(shù)量，給心房肌細(xì)胞培養(yǎng)帶來了困難。

哺乳動物心肌細(xì)胞在出生后的1 w具有部分分裂增殖能力，剛出生的心肌細(xì)胞增殖能力相對較強(qiáng)，本研究選用了出生48 h內(nèi)的乳兔為實(shí)驗(yàn)對象。胰酶及膠原酶用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊，濃度采用0.05% ～0.5%不等。消化時(shí)間偏長，胰酶對心肌細(xì)胞過度破壞，消化時(shí)間過短，膠原酶對細(xì)胞外膠原纖維降解不充分，不利于心肌細(xì)胞的游離;既保證將心肌細(xì)胞外基質(zhì)分解破壞，又盡可能減少酶對心肌細(xì)胞的破壞。一般采用37℃水浴提高胰酶消化效率，也有為了防止胰酶對心肌細(xì)胞的過度破壞采用4℃過夜消化法〔8〕。本研究用較低濃度的胰酶和膠原酶混合酶(混合后濃度均為0.1%)消化心房肌組織。對同一次取材組織進(jìn)行多次消化的方法，并對每一次提取的組織消化液及時(shí)終止消化，防止胰酶對心房肌細(xì)胞的過度破壞。被胰酶破壞的心房肌細(xì)胞釋放DNA，易引起細(xì)胞粘連成團(tuán)塊，在組織消化液中加入少量無菌的1 mg/ml的DNA酶預(yù)防。吸管對組織塊吹打時(shí)盡量輕柔，以800 r/min對組織消化液離心，盡量減少對心房肌細(xì)胞的機(jī)械損傷。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶消化后細(xì)胞存活率為85.2%，可以進(jìn)一步純化心房肌細(xì)胞。

本研究結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞能較長時(shí)間內(nèi)保持較高的活力。接種密度控制在1×105～5×105個(gè)/ml，接種密度過低造成細(xì)胞間的信號傳遞困難，不利于細(xì)胞生長及信號傳遞，接種過密細(xì)胞生長過早接觸抑制，營養(yǎng)不良，細(xì)胞生長及活力受限。

1 Harary I，F(xiàn)arley B.In vitro studies of single isolated beating heart cells〔J〕.Science，1960;131(3414):1674-5.

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