朱欠元 曾友根 張愈延 李寶金(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻喉科，江西 吉安 343000)

HSV-TK丙氧烏苷(GCV)是目前應(yīng)用最廣泛的自殺基因系統(tǒng)，雖在哺乳動(dòng)物內(nèi)具有高效的轉(zhuǎn)錄活性，但不具有腫瘤特異性，存在著對(duì)正常組織的毒副作用。因此，如何提高TK基因的殺傷效率及增強(qiáng)其腫瘤殺傷的靶向性，是當(dāng)前腫瘤基因療法中亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用KDR啟動(dòng)子構(gòu)建重組腺病毒載體，探討該系統(tǒng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷作用及旁殺效應(yīng)，為開展基因靶向腫瘤血管治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶來(lái)自TaKaRa公司;6孔板、96孔板為Corning公司產(chǎn)品;腺病毒系統(tǒng)穿梭質(zhì)粒ptrack由John Hopkins腫瘤中心提供;DMEM、胎牛血清、巨細(xì)胞病毒(GCV)、瓊脂糖、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒來(lái)自Gibco公司。人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2來(lái)自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院;含KDR-tk基因的質(zhì)粒 pBluescriptⅡKDR-tk、細(xì)菌 BJ5183-AD-1、293細(xì)胞，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由廣州市第八人民醫(yī)院李寶金博士提供。

1.2方法

1.2.1重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 擴(kuò)增pBluescriptⅡKDR-tk、ptrack與ptrack CMV質(zhì)粒，并酶切鑒定。凝膠電泳回收KDR-tk，將該基因片段與穿梭載體ptrack KDR-tk和ptrack CMV-tk進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)連接并鑒定。通過(guò)PmeⅠ酶切線性化穿梭載體ptrack KDR-tk或 ptrack CMV-tk。用 PmeⅠ酶切使穿梭載體ptrack KDR-tk、ptrack CMV-tk線性化，通過(guò)BJ5183-AD-1大腸桿菌與腺病毒骨架載體pAdeasy-1進(jìn)行重源重組成pAdKDR-tk和pAdCMV-tk，擴(kuò)增備用。

1.2.2重組腺病毒載體AdKDR-tk和AdCMV-tk的包裝與擴(kuò)增 293細(xì)胞在含15%胎牛血清DMEM，5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)后，按Lipofectamine 2000產(chǎn)品說(shuō)明，分別用重組腺病毒AdKDR-tk和AdCMV-tk載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞凍融，取病毒上清再感染293細(xì)胞大量擴(kuò)增。

1.2.3病毒滴度測(cè)定 24孔板中接種293細(xì)胞，將10倍倍比稀釋的待檢病毒懸液依次加入。感染1 h后吸去上清液，培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后通過(guò)觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.2.4HUVEC和CNE-2轉(zhuǎn)染與篩選 取病毒上清液分別感染HUVEC和CNE-2，置于含20%FCS和10 U/ml bFGF、1%明膠鋪底的培養(yǎng)基培養(yǎng)方瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)在含5%CO2、37℃孵箱中進(jìn)行傳代，分別命名為HUVEC/tk、CNE-2/tk細(xì)胞。

1.2.5體外GCV敏感實(shí)驗(yàn) 在96孔板中分別接種HUVEC和CNE-2，次日分別加入不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的AdKDR-tk及AdCMV-tk病毒系列稀釋溶液培養(yǎng)16 h后，實(shí)驗(yàn)孔更換不同濃度GCV的新鮮培養(yǎng)液，而對(duì)照孔予不含GCV的培養(yǎng)液，檢測(cè)細(xì)胞殺傷效應(yīng);將HUVEC及HUVEC/tk、CNE-2及CNE-2/tk按不同比例混合。接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度GCV，以不加GCV作為空白對(duì)照。采用MTT計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率=(GCV組平均吸光度/空白對(duì)照組平均吸光度)×100%，檢測(cè)旁殺效應(yīng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1PCR檢測(cè)HSV-tk基因片段 以轉(zhuǎn)染tk基因的293細(xì)胞進(jìn)行DNA擴(kuò)增，顯示一條300 bp片段，而正常293細(xì)胞為陰性，證明293細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后存在HSV-tk基因片段，見(jiàn)圖1。

2.2HUVEC/tk和CNE-2/tk測(cè)定 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC和CNE-2后熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白基因GFP的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1 PCR電泳圖譜

2.3GCV對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 不同MOI的AdKDR-tk轉(zhuǎn)染HUVEC和CNE-2后，對(duì)GCV有不同的敏感性。在MOI為100的條件下，GCV濃度由0增至50 mg/L時(shí)含AdKDR-HSV-tk的HUVEC和CNE-2細(xì)胞存活率從100%分別降至(23.1±3.9)%和(69.8±3.1)%(P＜0.01);感染 AdCMV-HSV-tk的HUVEC和CNE-2細(xì)胞存活率從100%分別降至(13.9±2.9)%和(15.7±5.2)%(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 AdKDR-tk感染后綠色熒光蛋白基因GFP的表達(dá)

圖3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞體外殺傷曲線

2.4GCV對(duì)細(xì)胞的旁觀者效應(yīng) 未轉(zhuǎn)染基因的HUVEC和轉(zhuǎn)染了KDR基因的HUVEC按不同的比例混合，各組細(xì)胞隨GCV濃度增加均受不同程度的抑制，并與劑量相關(guān)。75%HUVEC/tk+25%HUVEC組，其存活率已接近100%HUVEC/tk組，說(shuō)明GCV不僅殺傷HUVEC/tk，也殺傷了混合培養(yǎng)中未轉(zhuǎn)染tk基因的細(xì)胞，存在明顯的旁殺效應(yīng)，見(jiàn)圖4。

圖4 GCV對(duì)HUVEC的旁觀者效應(yīng)

3討論

腫瘤血管生成包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、出芽和遷移等，是腫瘤復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程之一，也是腫瘤侵襲生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的先決條件〔1〕?；谀[瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移與腫瘤血管密切相關(guān)，如何抑制腫瘤血管生成成為目前研究熱點(diǎn)。在眾多調(diào)控血管生成的內(nèi)源性因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前研究最多的一個(gè)。VEGF主要通過(guò)受體KDR發(fā)揮作用，改變血管外基質(zhì)成分，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，保持細(xì)胞的完整和存活。有研究表明〔2，3〕，KDR在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，而正常血管內(nèi)皮細(xì)胞KDR表達(dá)很低，使KDR可成為一個(gè)靶向腫瘤血管基因治療的啟動(dòng)子，具有高度特異性，通過(guò)阻止KDR達(dá)到抗腫瘤血管生成具有廣泛的應(yīng)用前景，并且已被證明是非常有效的〔4，5〕。

本研究構(gòu)建以KDR為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)自殺基因系統(tǒng)，將高度腫瘤特異性KDR與HSV-tk基因結(jié)合起來(lái)，提高了自殺基因系統(tǒng)靶向腫瘤血管和組織的準(zhǔn)確性，對(duì)正常組織影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AdKDR-HSV-tk自殺基因系統(tǒng)在GCV的作用下，對(duì)具有KDR表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷明顯，具有高度的特異性，其旁殺效應(yīng)也效果顯著，而對(duì)不表達(dá)KDR的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2無(wú)明顯殺傷作用。提示該系統(tǒng)可在腫瘤血管為靶點(diǎn)的腫瘤自殺基因治療中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步開展靶向腫瘤血管基因療法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011;144(5):646-74.

2 Liu L，Wu N，Li J.Novel targeted agents for gastric cancer〔J〕.Hematol Oncol，2012;5(31):1186.

3 Chekhonin VP，Shein SA，Korchagina AA，et al.VEGF in neoplastic angiogenesis〔J〕.Vestn Ross Akad Med Nauk，2012;(2):23-33.

4 Teng LS，Jin KT，He KF，et a.Advances in combination of antiangiogenic agents targeting VEGF-binding and conventional chemotherapy and radiation for cancer treatment〔J〕.J Chin Med Assoc，2010;73(6):281-8.

5 Teng LS，Jin KT，He KF，et al.Clinical applications of VEGF-trap(aflibercept)in cancer treatment〔J〕.J Chin Med Assoc，2010;73(9):449-56.