趙 穎 朱寶亮 李冬芹 宋曉雯 李慶周 范晴晴 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東 日照 276800)

研究表明，脂質(zhì)過氧化作用在許多疾病發(fā)病機(jī)制中起著一定作用〔1，2〕。丙二醛(MDA)是機(jī)體內(nèi)的氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物，它能使DNA、膜蛋白、酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，增加膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，對(duì)機(jī)體造成損傷甚至死亡〔3〕。對(duì)MDA的準(zhǔn)確測(cè)定可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而指導(dǎo)人們對(duì)機(jī)體的受損程度或耐受程度進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)，有助于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥理及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展〔4〕。目前MDA測(cè)定方法主要有分光光度法〔5〕，熒光法〔6〕，HPLC 法〔7〕，GC-MS 法〔8〕，試劑盒法。HPLC法、GC-MS由于儀器昂貴而難以普及;試劑盒法對(duì)多個(gè)樣品測(cè)定不經(jīng)濟(jì);分光光度法雖然操作簡便，但是測(cè)量結(jié)果不精確。本文采用一般實(shí)驗(yàn)條件可操作的硫代巴比妥酸(TBA)熒光分光光度法。由于肝臟中含有本底的干擾〔9，10〕，因而本文對(duì)熒光法微量精確測(cè)定肝臟MDA的實(shí)驗(yàn)條件及相關(guān)試劑進(jìn)行了改進(jìn)，測(cè)量正常和高脂的大鼠肝臟中MDA的含量，以期找到適用于一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝組織MDA含量微量差異的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 0.9%生理鹽水，丙酮，5%三氯乙酸，95%乙醇，無水乙醇，1%硫酸，硫代巴比妥酸(TBA，98%，北京百靈威科技有限公司)，2，6，-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，99.8%，北京百靈威科技有限公司)，1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP，97%，北京百靈威科技有限公司)，正丁醇，吡啶。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，無熒光雜質(zhì)。AR1140型電子分析天平(美國奧豪斯公司)，5810(R)高速冷凍離心機(jī)(德國eppendorf公司)，恒溫水浴箱(天津艾維歐公司)，F(xiàn)-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，手術(shù)剪，研缽等。

1.2動(dòng)物分組及處理 選用8周齡雄性SDS大鼠12只，隨機(jī)分為對(duì)照組、高脂飲食組(HL組)，每6只一籠。飼養(yǎng)5 w，飼養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)〔11〕。

1.3鼠肝勻漿的制備及去糖 大鼠禁食過夜，次日頸椎脫臼處死，開胸，剖開腹腔，用4℃生理鹽水清洗肝臟，用濾紙吸干表面水分，稱肝重，加入四倍肝臟重的0.9%的生理鹽水，在研缽中研磨成勻漿，低溫冷凍離心，3 000 r/min，15 min，取上清，轉(zhuǎn)移至另一心管，加入等體積95%的乙醇，再次低溫冷凍離心，3 000 r/min，15 min，取上清，即得去肝糖原的肝勻漿上清。

1.4MDA標(biāo)準(zhǔn)液的制備 取23.9 μl TEP于10 ml具塞試管內(nèi)，用1% 硫酸稀釋至100 ml刻度，室溫放置120 min后為10 mmol/L MDA貯備液。置冰箱4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ盟♂尦?00 μmol/L MDA溶液即為校準(zhǔn)曲線用工作液。該溶液于5℃下貯存可穩(wěn)定8 d。0測(cè)定前用水稀釋為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取MDA標(biāo)準(zhǔn)液200 μl置于具塞離心試管內(nèi)，加入20 μl BHT(20 g/L，溶于無水乙醇)，再加入1.5 ml TBA(0.35%TBA與5%TCA以2∶1體積比在臨用前混合)，震蕩1 min，100℃水浴1 h，至冰上終止反應(yīng)，加入2.5 ml正丁醇吡啶(15∶1)萃取液，充分振搖1 min，3 000 r/min離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)移至另試管中，以激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為553 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)量三次取平均值。此過程設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，除置室溫替代100℃水浴外，其他條件均相同。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度C(μmol/L)為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)管與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管熒光強(qiáng)度之差△F0為縱坐標(biāo)，用最小二乘法計(jì)算得回歸方程和相關(guān)性為:Y=205.04x+27.386，R2=0.9947 ，P ＜0.001 說明線性關(guān)系良好。

1.6樣品含量的測(cè)定 除用去糖的肝勻漿替代MDA標(biāo)準(zhǔn)液外，其操作同1.4。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

將 1.0 μml/L、2.0 μmol/L、3.0 μmol/L 的 MDA 標(biāo)準(zhǔn)液分別在90℃、95℃和100℃下和TBA反應(yīng)。100℃時(shí)的測(cè)定值的直線斜率最大(圖1)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用100℃。

表1 兩組肝勻漿反應(yīng)液熒光強(qiáng)度及MDA濃度(n=6)

圖1 不同溫度和濃度峰值之間的關(guān)系

3討論

本文將被測(cè)樣品和TBA呈色以后的紅色縮合物放置室溫(25℃)每隔10 min測(cè)定熒光值1次紅色縮合物在2 h內(nèi)穩(wěn)定。但日光直接照射可使顏色逐漸減退，因此，在實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)盡量避光。TBA法受到最主要的干擾因素就是組織內(nèi)的可溶性糖，而肝臟中大量的肝糖原在測(cè)定時(shí)降解為葡糖糖，因而如果不去除糖原本底的干擾，就不能正確地反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的水平。由于糖原不溶于乙醇，且乙醇作為一種較為溫和的有機(jī)溶劑，本身不會(huì)對(duì)MDA含量測(cè)定產(chǎn)生影響，因此利用乙醇使混合物中的糖原沉淀出來。本實(shí)驗(yàn)采用95%的乙醇去除肝糖原，比較除糖前后測(cè)定MDA的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除糖前的含量明顯高于除糖后的含量，平均高20%左右，而實(shí)際上高出的部分為肝臟中肝糖原所產(chǎn)生，測(cè)得的值并不是MDA的真實(shí)含量，從而干擾測(cè)定的準(zhǔn)確性。

將TBA配成0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和0.4%四種濃度，分別與10 μmol/L MDA標(biāo)準(zhǔn)液呈色，所測(cè)熒光峰高分別為1 700、1 936、2 013、2 246 nm 和 2 247 nm，說明 0.2%TBA 值明顯偏低，而＞0.35%TBA數(shù)值無明顯變化，但當(dāng)TBA濃度超過0.4%時(shí)不易充分溶解，故本實(shí)驗(yàn)選用0.35%TBA。TBA質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。本文選用北京百靈威科技有限公司樣品，為白色粉狀。配制時(shí)先將蒸餾水煮沸后再加入TBA，以減少TBA加熱時(shí)間，避免其自發(fā)水解而變?yōu)榉奂t色。TBA溶液配制以后須在1個(gè)月內(nèi)使用，避光放置37℃水箱可延緩沉淀析出如有少量沉淀析出時(shí)，臨用前復(fù)溶不影響檢測(cè)結(jié)果。

正丁醇和嘧啶混合溶劑在試驗(yàn)中起到萃取 MDA和 TBA反應(yīng)生成的粉紅色絡(luò)合物——三甲川的作用。在齊鳳菊等測(cè)定血清中MDA含量時(shí)表明正丁醇嘧啶(15∶1)混合液萃取效果較單用正丁醇好。而溶劑比影響著對(duì)其的提取率。本實(shí)驗(yàn)中采用不同的溶劑比對(duì)同一樣品不同體積進(jìn)行萃取，發(fā)現(xiàn)在溶劑比為15∶1時(shí)，測(cè)定值的直線斜率最大，故正丁醇嘧啶(15∶1)在也作為測(cè)定肝臟中MDA含量較佳試驗(yàn)條件。

MDA的測(cè)定是一項(xiàng)研究過氧化脂質(zhì)損傷的重要生化檢測(cè)指標(biāo)，而作為肝臟MDA的微量差異檢測(cè)沒有一套較實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的系統(tǒng)方法。本文通過系列實(shí)驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)的熒光硫代巴比妥酸法進(jìn)行改進(jìn):分別對(duì)正常和高脂的大鼠肝組織勻漿液上清先用95%乙醇消除肝糖原的影響，再與0.35%的硫代巴比妥酸在100℃條件下反應(yīng)，顯色后用正丁醇吡啶(15∶1)混合液萃取，最后用F-4600熒光分光光度計(jì)以激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為553 nm測(cè)定其熒光強(qiáng)度，進(jìn)而計(jì)算出肝組織中MDA的含量。改進(jìn)后的方法靈敏度為204.9，適用于一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝組織MDA含量微量差異的測(cè)定，可用于過氧化脂質(zhì)損傷對(duì)肝臟影響的機(jī)制研究。

1 劉愛英，金 輝，岳海波，等.犬心肌缺血后脂質(zhì)過氧化損傷及絞股藍(lán)總皂甙的干預(yù)效應(yīng)〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(15):3657-9.

2 周 滔，閆秀川，楊 珂，等.CCl4和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷中肝細(xì)胞凋亡病理特點(diǎn)比較〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007;15(5):347-50.

3 趙英政，徐光翠，張利利，等.低劑量鎘誘導(dǎo)雄性大鼠抗氧化損傷能力的適應(yīng)性反應(yīng)〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013;40(5):908-10.

4 Fattman CL，Schaefer LM，Oury TD.Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine〔J〕.Free Radic Biol Med，2003;35(3):236-56.

5 劉仲奇，胡永芳.脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物-丙二醛的簡便測(cè)定〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001;18(3):13-5.

6 Wojciech W，Jean N，Anne P.Optimized steps in fluorometricdetermination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum:importance of ext raction pH and influence of sample preservation and storage〔M〕.Clin Chem，1993;39(12):2522-6.

7 蔣小華，謝運(yùn)昌，李 娟，等.柱前衍生化反相高效液相色譜測(cè)定大鼠血漿中的丙二醛〔J〕.光譜實(shí)驗(yàn)室，2013;30(2):790-4.

8 Fitzmaurice PS，Tong J，Yazdanpanah M，et al.Levels of 4-hydroxynonenal and malondialdehyde are increased in brain of human chronic users of methamphetamine〔J〕.Pharmacol Exp Ther，2006;319(2):703-9.

9 張建新.熒光法測(cè)定血清脂質(zhì)過氧化物的最佳反應(yīng)條件〔J〕.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1998;32(1):40-2.

10 劉 彬，齊 云，李 蒙，等.分光光度法與熒光法測(cè)定肝組織丙二醛含量的比較研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010;26(12):1674-7.

11 朱寶亮，趙 穎，劉 景，等.四氫生物蝶呤對(duì)大鼠低密度脂蛋白氧化修飾的作用及其機(jī)制探討〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012;28(5):449-53.

12 察冬梅.淺議靈敏度、檢出限和測(cè)定限〔J〕.大學(xué)化學(xué)，2011;26(4):84-6.