趙為民++涂楓++任守文++方曉敏++李碧俠++趙芳++付言峰++王學(xué)敏

摘要：激活素A（Activin A）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming/mL growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員，具有重要的生物學(xué)功能。為研究Activin A在肌肉發(fā)育中的作用，以大鼠肌細(xì)胞L6為研究模型，通過時(shí)空表達(dá)譜、CCK-8以及流式細(xì)胞周期分析等方法來進(jìn)行研究。結(jié)果表明Activin A隨著肌細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)向分化狀態(tài)，其表達(dá)量呈下降趨勢。添加不同濃度的Activin A（5～25 ng/mL）均能顯著促進(jìn)L6細(xì)胞的增殖速度，且這種促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)隨著Activin A濃度的增大而逐漸增強(qiáng)。Activin A能顯著增加S期在細(xì)胞周期中的比例，同時(shí)縮短G1和G2期在細(xì)胞周期中所占的比例。此外，通過添加Activin A顯著抑制了肌肉分化標(biāo)記基因Myog的表達(dá)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究 Activin A在肌肉發(fā)育中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大鼠；激活素A（Activin A）；肌細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)： S828.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0287-03

收稿日期：2016-09-12

基金項(xiàng)目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（編號(hào)：2014ZX08006-003）；國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-36）。

作者簡介：趙為民（1983—），男，湖北鐘祥人，博士，助理研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因與育種研究。Tel：（025）84391941；E-mail：zhao_weimin1983@aliyun.com。

通信作者：王學(xué)敏，碩士，助理研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因與豬生產(chǎn)研究。Tel：（025）84391941；E-mail：wxm116@sina.com。

Activin A最初是從豬的卵泡液中分離的一種糖蛋白，通過二硫鍵連接2個(gè)β A亞基構(gòu)成二聚體形式[1]。Activin A作為TGF-β 超家族的一員，通過與其受體ActRⅡ/ⅡB結(jié)合，激活下游的Smad2/ Smad3通路，從而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。Activin A最初的功能是刺激卵泡刺激素（follicle-stimulating/mL hormone，F(xiàn)SH）的分泌，促進(jìn)卵泡發(fā)育[1]，后來發(fā)現(xiàn)Activin A在其他的生理過程中也發(fā)揮著重要作用。研究表明Activin A在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]，例如它在由脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中能調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥因子的表達(dá)[3]，此外在呼吸道過表達(dá)Activin A可誘導(dǎo)嚴(yán)重的肺部炎癥反應(yīng)[4]。Activin A還能促進(jìn)包括睪丸支持細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖[5-7]。近年來報(bào)道顯示Activin A在肌肉的生長發(fā)育中也起到重要作用。Activin A在IL-1α和TNF-α炎癥因子處理后的肌細(xì)胞分化中起到抑制作用[8]。過量的Activin A可導(dǎo)致肌肉的萎縮和惡病質(zhì)，且這種效應(yīng)比MSTN還要強(qiáng)[9]。MSTN是肌肉發(fā)育的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，通過基因編輯技術(shù)敲除MSTN可使生物個(gè)體如豬表現(xiàn)出典型的雙肌性狀[10-11]，這說明 Activin A可作為一個(gè)新的肌肉靶標(biāo)基因，通過對其敲除可為適度提高我國地方豬品種的瘦肉率提供一種新途徑。然而 Activin A在肌肉發(fā)育中的作用機(jī)制仍不清楚，這阻礙了對其進(jìn)行有效挖掘和利用。本研究利用大鼠肌細(xì)胞L6為模型，探討Activin A在肌細(xì)胞增殖分化中的作用，這將有助于更好地揭示Activin A基因在肌肉發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也為進(jìn)一步在豬上進(jìn)行基因編輯Activin A的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

Trans1-T1菌株購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；大鼠L6肌細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；Activin A重組蛋白購于R&D Systems；RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；CCK-8購于日本同仁；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）、Taq酶、PrimeScriptTM RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 TaKaRa公司；Activin A ELISA試劑盒購于武漢博士德生物；DEME、胎牛血清、雙抗購于Thermo Fisher公司；引物合成、基因測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2RNA的提取及cDNA的合成

RNA提取主要步驟：細(xì)胞加入Trizol裂解液室溫裂解 5 min，然后加入200 μL氯仿混勻15 s，靜置3 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min，取上清約400 μL，轉(zhuǎn)移到新的 1.5 mL EP管中，加入等體積的70%乙醇，顛倒混勻，10 000 r/min 過柱離心45 s，棄掉廢液。加 500 μL去蛋白液 RE，12 000 r/min 離心 45 s，棄掉廢液。加入 700 μL 漂洗液 RW 12 000 r/min離心 60 s，棄掉廢液。加入 500 μL 漂洗液 RW，12 000 r/min 離心 60 s，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回空收集管中，12 000 r/min 離心 2 min，在吸附膜的中間部位加適量 RNase free 水，室溫放置 2 min，12 000 r/min 離心 1 min，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA的合成主要步驟為：500 ng/mL RNA，2 μL 5×primescript RT Master Mix，補(bǔ)水至10 μL。37 ℃ 反應(yīng)15 min，85 ℃ 處理1 min，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3熒光定量PCR

熒光定量PCR按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書操作，體系如下：cDNA 2 μL，2 ×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，Rox reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，補(bǔ)水到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.4L6肌細(xì)胞培養(yǎng)及分化

L6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基（90%DEME+10%胎牛血清+1%雙抗）中，然后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其密度達(dá)到80%時(shí)，按照1 ∶[KG-*3]3傳代。待分化時(shí)，換成含2%馬血清的DMEM進(jìn)行分化，每2 d換1次培養(yǎng)液。

1.5Activin A ELISA測定

參照試劑盒說明，主要步驟：加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃反應(yīng) 90 min。[JP3]不洗。加生物素標(biāo)記抗體，37 ℃反應(yīng) 60 min，1×洗滌緩沖液洗滌 3 次。加 ABC，37 ℃反應(yīng) 30 min，1×洗滌緩沖液洗滌 5 次。TMB 37 ℃反應(yīng) 20～25 min，加入 TMB 終止液，讀數(shù)。

1.6細(xì)胞增殖分析

在96孔板中接種L6細(xì)胞，然后將96孔板放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）12 h后，每組加入終濃度為5、10、25 ng/mL 的Activin A，每個(gè)處理組重復(fù)4次，分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1～4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.7細(xì)胞周期分析

細(xì)胞用胰酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，離心去PBS，加入 4 ℃預(yù)冷的70%乙醇-20 ℃固定過夜，次日離心棄去固定液，用 4 ℃預(yù)冷PBS 5 mL 洗細(xì)胞2次，加入0.5 mL PBS[含 50 μg /mL 碘化乙錠（PI），100 μg /mL RNase A]重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.8數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)（α=0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1Activin A在肌細(xì)胞增殖分化中的表達(dá)

如圖1-A所示，隨著L6細(xì)胞由增殖期（growth medium，GM）轉(zhuǎn)向分化期（differentiation medium，DM）的第1天（DM1）和第3天（DM3），Activin A蛋白在L6細(xì)胞增殖期的表達(dá)量要極顯著高于其在L6細(xì)胞分化期的表達(dá)量（P<001）。Myog作為一個(gè)肌肉分化標(biāo)記基因用來指示肌細(xì)胞的分化狀態(tài)，從圖1-B可以看出，隨著L6細(xì)胞的分化，Myog表達(dá)量從GM到DM1及DM3也極顯著上升（P<0.01），說明L6細(xì)胞分化成功。

2.2Activin A 對肌細(xì)胞增值的作用

由圖2可見，當(dāng)添加不同濃度的Activin A 培養(yǎng)24 h后，L6細(xì)胞的增殖速度在各濃度之間并無顯著差異。當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至48 h和72 h后，Activin A的效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)出來。在48 h中，添加5 ng/mL的細(xì)胞增殖速度要顯著高于對照組（P<005），而添加10 ng/mL和25 ng/mL的細(xì)胞增殖速度要極顯著高于對照組（P<0.01），Activin A對細(xì)胞增殖的效應(yīng)隨著濃度的增大而逐漸增強(qiáng)。Activin A對L6細(xì)胞在72 h的增殖情況與48 h的增殖情況類似，但都達(dá)到差異極顯著（P<001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在72 h時(shí)，不同濃度的Activin A對細(xì)胞增殖的幅度都要高于其在48 h時(shí)對細(xì)胞增殖的幅度。

2.3Activin A 對肌細(xì)胞周期的作用

為了探討Activin A是否通過影響細(xì)胞周期來影響細(xì)胞增殖，添加Activin A培養(yǎng)48 h后，通過流式細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)Activin A能影響L6細(xì)胞各個(gè)周期的比例大?。▓D3-A）。與對照組相比，Activin A能極顯著提高S期在細(xì)胞周期中的比例（P<0.01），同時(shí)極顯著降低G1和G2期在細(xì)胞周期中的比例（P<0.01）（圖3-B）。

2.4Activin A 對肌細(xì)胞分化的影響

由圖4可見，在L6細(xì)胞分化液中添加Activin A培養(yǎng) 48 h 后，通過定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Activin A極顯著抑制了肌肉分化標(biāo)記基因Myog的表達(dá)（P<0.01）。

3討論

骨骼肌發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，在一系列轉(zhuǎn)錄因子例如PAX3/PAX7、生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）以及其他基因的相互作用下，由生肌前體細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，后者再經(jīng)過增殖、分化、融合形成多核肌管，最終發(fā)育形成肌纖維和肌肉組織[12-13]，因而肌細(xì)胞如何增殖和分化成為研究肌肉發(fā)育機(jī)制的重點(diǎn)。

研究表明基因的表達(dá)水平往往與其細(xì)胞所處的狀態(tài)緊密相關(guān)[14-15]。當(dāng)肌細(xì)胞L6由增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)向分化狀態(tài)時(shí)，可以看到Activin A的表達(dá)量顯著下降，說明其可能與L6細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明當(dāng)外源添加Activin A后，細(xì)胞增殖的速度明顯高于對照組，說明其確實(shí)促進(jìn)了細(xì)胞增殖，且這種促進(jìn)效應(yīng)顯現(xiàn)出濃度依賴性，這與Activin A對其他細(xì)胞的增殖效應(yīng)[7]相似。細(xì)胞周期分為G1、S、G2/M等3個(gè)時(shí)期，G1是細(xì)胞的合成前期，而S期是細(xì)胞DNA的復(fù)制期[CM（25]，當(dāng)細(xì)胞不可逆地退出細(xì)胞周期后開始分化[16]，因而調(diào)節(jié)這2個(gè)時(shí)期的比例大小可影響細(xì)胞的增殖與分化。研究表明一些miRNA基因可通過促進(jìn)G1期的停滯來促進(jìn)肌細(xì)胞的分化[17-18]，相反一些miRNA可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖以及提高細(xì)胞周期中S期比例來抑制肌細(xì)胞的分化[19]。本研究表明 Activin A可降低L6細(xì)胞周期中G1和G2期的比例而增加S期的比例，同時(shí)結(jié)合添加Activin A可抑制肌肉分化標(biāo)記基因Myog的表達(dá)，說明Activin A很可能是通過上述機(jī)制來抑制肌細(xì)胞的分化，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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