張鳳香 關(guān) 寧 李晨光 羅俊生 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科，遼寧 錦州 121001)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β是由許多具有相同生物學(xué)特性的信號(hào)分子共同組成的一個(gè)大家族。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成和狹窄等過(guò)程〔1〕。膽固醇酯水解酶(CEH)是一種催化酶，它在動(dòng)AS過(guò)程中起重要作用，它能催化膽固醇酯(CEs)水解為游離膽固醇(FC)，從而促進(jìn)膽固醇外流，減少CEs在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)定，抑制單核巨噬細(xì)胞的泡沫化〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Ad-TGF-β1作用于巨噬細(xì)胞，觀察其是否對(duì)巨噬細(xì)胞CEH表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而探討二者在AS過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1.1材料 THP-1人單核巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自碧云天公司;兔抗鼠CEH單克隆體、兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司;小鼠CEH酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購(gòu)自晶美公司;人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1購(gòu)自Gibco公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 THP-1人單核巨噬細(xì)胞于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，去除未貼壁細(xì)胞后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每24～48 h傳代一次。在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞加入5 ng/ml人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1分別刺激24、48、72 h，隨后收集細(xì)胞。

1.3RT-PCR檢測(cè)TGF-β1和 CEH的表達(dá) 收集并計(jì)數(shù)各組細(xì)胞，按5×106個(gè)細(xì)胞加1 ml RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)表達(dá)。CEH的上游引物為:5'-GCATCCGGATCCACCCAGAA-3'，下 游 引 物 為:5'-GAAAGAGTCAAAGATGGTGCCAGA-3'。TGF-β1 上游引物為:5'-CTGCTCACCCAACATTTCGT-3'，下游引物為:5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATCAA-3'。內(nèi)參β-actin的上游引物為:5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物為:5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。擴(kuò)增條件為:95℃ 30 s;94℃ 5 s，61℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.4Western印跡法檢測(cè)TGF-β1和CEH的表達(dá) 收集各組細(xì)胞以冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液提取總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測(cè)定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。與1∶1 000兔抗鼠CEH單克隆抗體、1∶300兔抗鼠CEH單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶200)，4℃孵育2 h。洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光底物顯影，凝膠成像。

1.5ELISA法檢測(cè)CEH的分泌情況 按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，加入處理因素，分別培養(yǎng)24、48、72 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。從平衡至室溫的密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，留空白孔。加0.1 ml離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于反應(yīng)孔中，置37℃孵育90 min。然后洗板5次。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶結(jié)合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml顯色底物液，37℃避光孵育15 min:于各反應(yīng)孔中加入終止液0.1 ml，混勻后即可測(cè)量OD450值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，行ANOVA分析。

2結(jié)果

2.1PT-PCR檢測(cè)Ad-TGF-β1刺激的巨噬細(xì)胞CEH的表達(dá)隨著Ad-TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(24、48、72 h分別為 25.21 ±1.04，61.96 ±1.46，99.34±2.45);同時(shí)CEH的mRNA表達(dá)水平也隨之明顯增強(qiáng)(24、48、72 h分別為 19.2 ±1.17，53.53 ±1.78，82.17 ±2.01，圖1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)Ad-TGF-β1對(duì)巨噬細(xì)胞中CEH和TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

2.2Western印跡法檢測(cè)Ad-TGF-β1刺激的巨噬細(xì)胞CEH的表達(dá) Western印跡法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，72 h組高于48 h組，48 h組又高于24 h組，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴關(guān)系，即隨著Ad-TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)TGF-β1的蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng);同時(shí)CEH的蛋白表達(dá)水平也隨之被明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

2.3ELISA法檢測(cè)Ad-TGF-β1刺激的巨噬細(xì)胞CEH的分泌情況 Ad-TGF-β1刺激的巨噬細(xì)胞上清液中CEH的含量變化趨勢(shì)與前述研究結(jié)果相似，72 h組CEH含量最高隨著Ad-TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)巨噬細(xì)胞上清液CEH的含量明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 Western印跡檢測(cè)Ad-TGF-β1對(duì)巨噬細(xì)胞中CEH和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

表1 Ad-TGF-β1 對(duì)巨噬細(xì)胞中 CEH、TGF-β1表達(dá)的影響(x ± s，n=6)

3討論

AS是缺血性腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，而單核巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞可以通過(guò)吞噬血管內(nèi)皮下大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞構(gòu)成斑塊脂質(zhì)核心，而當(dāng)泡沫細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)可以釋放膽固醇酯(CEs)，CEs可以在血管壁損傷處大量聚集形成了AS壞死核心，直接引起蜂窩狀易碎斑塊的形成〔3，4〕。

CEH是一種催化CEs水解為FC的酶，它可以在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，減少CEs在巨噬細(xì)胞內(nèi)的蓄積，從而降A(chǔ)S的形成。研究發(fā)現(xiàn)［5〕CEH的表達(dá)水平同AS的易感性呈負(fù)相關(guān)，抑制CEH的表達(dá)可以明顯降低形成AS的風(fēng)險(xiǎn)。

TGF-β1在巨噬細(xì)胞內(nèi)可以大量表達(dá)，它不但具有多種生物學(xué)功能，還在AS斑塊的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔6〕。臨床研究表明在AS性血管病變中，巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇酯的水平和泡沫細(xì)胞的形成與單核、巨噬細(xì)胞中的TGF-β1濃度呈負(fù)相關(guān)〔7〕。上述我們得知，CEH和TGF-β1均能在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)表達(dá)的變化來(lái)影響AS的形成，但CEH和TGF-β1之間是否存在聯(lián)系尚不得而知。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Ad-TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CEH的表達(dá)水平也隨之被明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴關(guān)系，說(shuō)明可以通過(guò)增強(qiáng)TGF-β1的表達(dá)來(lái)提高CEH的表達(dá)。接下來(lái)又通過(guò)ELISA法檢測(cè)Ad-TGF-β1刺激的巨噬細(xì)胞CEH的分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Ad-TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)巨噬細(xì)胞上清液CEH的含量明顯增強(qiáng)，說(shuō)明可以通過(guò)提高TGF-β1的表達(dá)來(lái)影響CEH的分泌情況。

綜上，本研究結(jié)果顯示提高TGF-β1的表達(dá)可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)CEH的表達(dá)，但其在AS形成過(guò)程中的作用還需進(jìn)行更深一步的研究。

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