康文博陳翀李曉紅王景景涂悅張賽梁海乾

過表達NeuroD1對脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元的影響☆

康文博*陳翀*李曉紅*王景景*涂悅*張賽*梁海乾*

目的 探討過表達NeuroD1對脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元的影響。方法 體外原代培養(yǎng)SD大鼠脊髓星形膠質細胞，以劃痕實驗制備反應性星形膠質細胞。實驗分為空白組（NV組）、對照病毒組（GFP組）和NeuroD1病毒組（NeuroD1組）。各組行劃痕處理7 d后，NV組不感染病毒，GFP組感染攜帶GFP基因的逆轉錄病毒，NeuroD1組感染同時攜帶GFP和NeuroD1基因的逆轉錄病毒，24 h后同時更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基。各組在1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d觀察細胞形態(tài)，并采用免疫熒光染色方法分別在感染病毒后7 d觀察細胞DCX陽性率和14 d觀察細胞NeuN陽性率。結果 更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基后，各組細胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長。與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細胞突起短而分枝多，胞核較小。感染病毒后7 d，NV組和GFP組細胞部分形態(tài)逐漸恢復以前形態(tài)而NeuroD1組維持變化后形態(tài)。與NV組和GFP組相比，NeuroD1組出現(xiàn)DCX（9.84%±2.06%）（F=40.107）和NeuN（8.25%±2.78%）陽性細胞（F=21.73），結果差異都有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 在體外培養(yǎng)，NeuroD1的過表達可以介導體外培養(yǎng)脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元。

NeuroD1轉分化 反應性星形膠質細胞 神經(jīng)元 劃痕

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種破壞性極大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，可造成嚴重的肢體功能障礙，使患者喪失勞動能力，給家庭和社會造成沉重的負擔。SCI后，在細胞水平會出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡缺失、軸突斷裂，并且數(shù)量最多的星形膠質細胞會迅速活化形成反應性星形膠質細胞（reactive astrocytes，RAS）［1］。RAS過度增生形成的膠質瘢痕不僅對軸突的再生起到了物理阻擋作用［2-3］，還可分泌和釋放多種生長抑制因子和炎性因子來抑制軸突再生，嚴重阻礙神經(jīng)功能恢復［4-5］。近年來，細胞轉分化技術蓬勃發(fā)展，這種技術可以直接將某一種成體終末分化細胞特定轉化為其他種類的終末分化細胞或某種細胞的前體階段［6-8］。但是將RAS直接轉分化為神經(jīng)元的研究很少。本研究在細胞階段，將攜帶神經(jīng)分化因子1（Neuronal differentiation 1，NeuroD1）基因的逆轉錄病毒感染反應性星形膠質細胞，以探討過表達NeuroD1對導脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元的影響。

1　材料與方法

1.1研究對象SD孕鼠1只，用于1～3 d新生鼠的原代星形膠質細胞的提取和培養(yǎng)，由解放軍軍事醫(yī)學科學院提供。試劑：DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12）培養(yǎng)基（Gibco，美國）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（Gibco，美國）、小鼠抗Nestin抗體（Abcam，英國）、兔抗GFAP抗體（Sigma，美國）、小鼠抗NeuN抗體（Abcam，英國）、兔抗DCX抗體（Sigma，美國）、FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗（Life technology，美國）、FITC標記的山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美國）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）（peprotech，以色列）、B-27（Gibco，美國）、固定液（BD，美國）、破膜液（BD，美國）、同型對照抗體（BD，美國）。病毒：對照病毒攜帶GFP基因，NeuroD1病毒攜帶GFP和NeuroD1基因，均為逆轉錄病毒，以MOI值1:100感染細胞，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。由上海和元生物科技有限公司提供。實驗分為空白組（NV組）、對照病毒組（GFP組）和NeuroD1病毒組（NeuroD1組）。各組行劃痕處理7 d后，NV組不感染病毒，GFP組感染攜帶GFP基因的逆轉錄病毒，NeuroD1組感染同時攜帶GFP和NeuroD1基因的逆轉錄病毒，24 h后同時更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2原代星形膠質細胞的提取和鑒定 取1～3 d新生SD大鼠，用75%的酒精浸泡5 min，無菌條件下分離后背皮膚、肌肉與脊椎，暴露脊髓，取出脊髓放入0.01 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）中去除脊髓膜和血管等組織，置于DMEM/F12培養(yǎng)基中用200目不銹鋼濾網(wǎng)進行研磨，將濾液轉移至15 mL離心管，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化1～2 min，用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化，再次離心，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀置于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h差速粘附，更換培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)至長滿80%～90%，置于恒溫搖床260 r/ min振蕩16 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)并檢測純度［9-10］，以備后用。流式細胞術檢測星形膠質細胞純度：傳至第3代后，將星形膠質細胞消化離心收集細胞，加入固定液500 μL懸浮沉淀并進行固定20 min，1400 r/min離心10 min，加入破膜液，取所制樣品各100 μL分別加入兩個離心管，一只再加入兔抗GFAP抗體5 μL，另一只加入同型對照抗體20 μL，4℃、40 min，上機檢測。

1.3劃痕損傷制備RAS將星形膠質細胞以1×104種植于48孔板，用10 μL無菌加樣槍頭沿“井”字劃痕，劃痕間距0.3 mm，劃痕時保持勻速和相同力度。劃后換液除去脫落和死亡細胞及碎片，每隔3 d半量換液［11］。免疫熒光（Nestin/GFAP）染色檢測RAS：劃痕7 d后，4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS浸洗3×5 min，0.5%Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5%BSA封閉孵育20 min，加入一抗（1:1000）兔抗大鼠GFAP標記星形膠質細胞，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，再加入Nestin（1:300）小鼠抗大鼠標記活化的反應性星形膠質細胞，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，后續(xù)操作避光，加入二抗（1: 200）羊抗兔抗體綠色，37℃、孵育1 h，PBS浸洗3× 10 min，再加入二抗（1:200）羊抗小鼠抗體紅色，37℃、1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI染核（1: 100），37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4免疫熒光檢測轉分化效率 分別在感染病毒7 d、14 d行免疫熒光染色。感染病毒后7 d的各組細胞分別加入一抗（1:300）兔抗DCX抗體標記早期神經(jīng)元，各組用DAPI染細胞核。感染病毒后14 d的各組細胞分別加入一抗（1:200）小鼠抗NeuN抗體標記成熟神經(jīng)元，各組用DAPI染細胞核。熒光顯微鏡觀察各時間點的轉分化效率。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0處理實驗數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用完全隨機設計的方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，檢測水準α=0.05。

2　結果

2.1原代星形膠質細胞純度檢測 第3次傳代后星形膠質細胞純度檢測，見圖1。實驗分兩組，同型對照熒光（圖1A）和GFAP熒光（圖1B）。數(shù)據(jù)結果顯示純度為93.94%，符合實驗要求，以備后續(xù)實驗。

圖1　流式細胞術檢測星形膠質細胞細胞的純度。圖1A顯示為同行對照的熒光范圍，圖1B顯示為樣品的熒光范圍，C圖顯示為同行對照和樣品疊加的范圍。

2.2免疫熒光檢測RAS倒置熒光顯微鏡下觀察，見圖2，各組取6個視野記錄Nestin陽性細胞數(shù)和GFAP陽性細胞數(shù)。RAS可以特異性表達Nestin［12］，同時可以表達GFAP，因此Nestin陽性率可以表示RAS的純度。Nestin陽性率=（Nestin陽性細胞數(shù)/ GFAP陽性細胞數(shù)）×100%，各視野Nestin陽性率均大于90%，符合試驗要求，以備后續(xù)實驗。

圖2　熒光顯微鏡（200×）下觀察，紅色熒光為Nestin，標記RAS，綠色熒光為GFAP陽性細胞，標記星形膠質細胞，藍色熒光為DAPI陽性細胞，標記細胞核。標尺刻度為100μm

2.3顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變 光學顯微鏡下分別在感染后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d觀察各組的細胞形態(tài)和劃痕處細胞的改變，見圖3。感染后7 d內(nèi)，各組細胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長。與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細胞突起短而分枝多，胞核較小。病毒感染后7 d，NV組和GFP組細胞形態(tài)逐漸恢復以前形態(tài)而NeuroD1組維持變化后形態(tài)。

2.4免疫熒光染色結果 分別在感染病毒后7 d觀察DCX陽性率（圖4）和14 d觀察NeuN陽性率（圖5）。倒置熒光顯微鏡下觀察，各組取6個視野記錄DCX或NeuN陽性細胞數(shù)和GFP陽性細胞數(shù)。DCX或NeuN陽性率=（DCX或NeuN陽性細胞數(shù)/ GFP陽性細胞數(shù)）×100%。NV組和GFP組的陽性率近乎為0，NeuroD1組的DCX陽性率為9.84%± 2.06%（F=40.107），NeuN陽性率為8.25%±2.78%（F=21.73），都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3　討論

圖3　光學顯微鏡（100×）下觀察不同時間細胞改變，A組為NV組，B組GFP組，C組NeuroD1組，分別在3 d、7 d和14 d時細胞形態(tài)的變化

圖4　熒光顯微鏡（200×）下觀察，綠色熒光為GFP陽性細胞，為感染病毒后細胞的自發(fā)熒光，紅色熒光為DCX陽性細胞，標記早期神經(jīng)元，藍色熒光為DAPI陽性細胞，標記細胞核。A組為NV組，B組為GFP組，對照組為NeuroD1組。標尺刻度為100μm

圖5　熒光顯微鏡（200×）下觀察，綠色熒光為GFP陽性細胞，為感染病毒后細胞的自發(fā)熒光，紅色熒光為NeuN陽性細胞，標記成熟神經(jīng)元，藍色熒光為DAPI陽性細胞，標記細胞核。A組為NV組，B組為GFP組，對照組為NeuroD1組。標尺刻度為100μm

在脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質細胞的數(shù)量約為神經(jīng)元的4～5倍。SCI后，神經(jīng)元的缺失同時伴隨星形膠質細胞迅速活化為RAS，后者會過度增生形成瘢痕微環(huán)境抑制軸突再生和神經(jīng)功能的恢復。目前，SCI尚缺乏有效的治療措施，神經(jīng)元較差的再生能力和抑制性膠質微環(huán)境的形成已被公認為是SCI后軸突再生和功能恢復障礙的關鍵性因素。目前最流行的是細胞替代治療技術，已從胚胎干細胞發(fā)展到多能誘導干細胞重編程技術［13］，現(xiàn)在已進入了轉分化技術的時代。轉分化技術可以直接將RAS轉分化為神經(jīng)元［14-15］。這樣一方面解決了膠質瘢痕問題，解除了對神經(jīng)軸突再生的抑制；另一方面解決了神經(jīng)發(fā)生的問題，如誘導的神經(jīng)元與損傷處微環(huán)境整合，發(fā)揮神經(jīng)傳導的功能，這將對SCI神經(jīng)功能的修復有著重要的意義。近年來，RAS轉分化為神經(jīng)元的相關研究不斷深入，轉分化誘導條件不斷成熟且誘導方式逐漸多樣性，這為神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的患者帶來了曙光。

本研究將攜帶NeuroD1基因的逆轉錄病毒感染RAS，以探討NeuroD1的過表達能否介導脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元。實驗結果表明：①感染后7 d內(nèi)，各組細胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長。各組細胞都發(fā)生類似的改變可能是由于細胞為了適應環(huán)境改變而發(fā)生的形態(tài)變化。②與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細胞突起短而分枝多，胞核較小。說明NeuroD1組病毒的NeuroD1基因整合到了RAS基因組并開始了轉錄和翻譯，形態(tài)開始向神經(jīng)元改變。而NV組和GFP組細胞發(fā)生改變只是適應性的改變。病毒感染后7 d，NV組和GFP組大部分細胞形態(tài)逐漸恢復以前形態(tài)而NeuroD1組大多維持變化后形態(tài)。更能說明NeuroD1基因發(fā)揮了明顯的作用。③NV組和GFP組的DCX、NeuN陽性率均近乎為0，NeuroD1組的DCX陽性率為（9.84%±2.06%），NeuN陽性率為（8.25%± 2.78%），都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明在病毒感染后7 d，NeuroD1的過表達介導脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為早期神經(jīng)元；而感染后14 d，轉分化為成熟神經(jīng)元。

綜上所述，將攜帶NeuroD1基因的逆轉錄病毒感染反應性星形膠質細胞后，NeuroD1的過表達可以介導脊髓反應性星形膠質細胞轉分化為神經(jīng)元。本研究所進行的體外實驗為后期的體內(nèi)實驗提供了可靠的理論依據(jù)。但是還存在一些不足：①轉分化的效率很低；②轉分化而來的神經(jīng)元是否可以有電活動未經(jīng)證明。以上問題有待后續(xù)的實驗進一步研究。

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The influence of overexpression of NeuroD1 on transdifferentiation of spinal cord reactive astrocytes intoneurons.

KANG Wenbo，CHEN Chong，LI Xiaohong，WANG Jingjing，TU Yue，ZHANG Sai，LIANG Haiqian.Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China.Tell：022-60577125.

Objective To investigate the effect of the overexpression of NeuroD1 on mediating transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.Methods Spinal cord astrocytes were cultured from the SD rat，and reactive astrocytes were prepared by scratches treatment.Cells were divided into blank groups（NV group），control virus group（GFP group）and NeuroD1 virus group（NeuroD1 group）.At 7 d after scratches treatment，GFP and NeuroD1 groups were infected with retroviruses carrying the GFP gene and and GFP gene plus NeuroD1 gene，respectively，whereas NV group was not infected with the virus.Twenty-four hours late，the culture medium were replaced by neuron conditioned medium.Cell morphology was examined at 1，2，3，5，7 and 14 d.DCX positive and NeuN positive cells were detected at 7 d and 14 d after infection by using immunofluorescence staining method，respectively.Results After replacement with the neuron conditioned medium，the nucleus was obviously plump，the cytoplasm was thin and neurites was reduced and extended.Compared with the NeuroD1 group，neurites of NV group and GFP group were shorter with many branches andthe nucleus was smaller.At 7 d after infection，cell morphology of NV group and GFP group gradually recovered，but cell morphology of NeuroD1 group did not.Compared with NV group and GFP group，NeuroD1 group had more DCX（9.84± 2.06%）and NeuN（8.25±2.78%）positive cells［F values 40.107 for DCX and 21.73 for NeuN（P＜0.05）］.Conclusion The overexpression of NeuroD1 can mediate the transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.

NeuroD1 Transdifferentiation Reactive Astrocytes Neurons Scratches

R651

A

2015-03-27）

（責任編輯:甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.09.010

☆國家自然科學基金項目（編號：81301050，81271392，81401067）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（編號：14JCQNJC10200，15JCYBJC28100）；中國博士后基金項目（編號：2013M542583）

*武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室（天津 300162）