錢志瑤 周道堂 黃秀平 周鎂 陳祖云 覃容貴

（貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550004）

黔產寬葉纈草ISSR反應體系的建立與優(yōu)化

錢志瑤 周道堂 黃秀平 周鎂 陳祖云 覃容貴

（貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550004）

旨在建立穩(wěn)定、可靠的寬葉纈草ISSR反應體系。以10個水平單因素試驗為基礎，應用L16（45）正交設計對反應體系中4個主要因子在 4個水平上進行組合優(yōu)化，并采用直觀法、極差法和方差法對試驗結果進行分析；利用優(yōu)化的反應體系，篩選引物以及最佳退火溫度；同時，以9份不同產地寬葉纈草樣品對反應體系進行穩(wěn)定性檢測。結果顯示，寬葉纈草25 μL ISSR最佳反應體系為：2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補齊；影響大小依次是：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶；確定了各引物的最佳退火溫度以及篩選出擴增條帶清晰穩(wěn)定的17條ISSR引物；穩(wěn)定性實驗表明，該體系穩(wěn)定可靠。優(yōu)化出寬葉纈草ISSR最佳反應體系并篩選出理想的引物。

寬葉纈草；ISSR；單因素試驗；正交設計；體系優(yōu)化

寬 葉 纈 草（Valeriana officinalis L.var. latifolia Miq）是敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana Linn）植物，具有安心神、祛風濕、行氣血、止痛的功效，主治心神不安、心悸失眠、血狂、臟躁、風濕痹痛、脘腹脹痛、痛經、經閉、跌打損傷等作用［1，2］。貴州地區(qū)山多，氣候溫和，山陰多潮濕，具有得天獨厚的區(qū)域優(yōu)勢和自然條件，是纈草生長最好的地理環(huán)境［3］。貴州纈草產業(yè)的主打產品就是纈草油，寬葉纈草油利用價值高，用途廣，國外已有大面積栽培寬葉纈草［4，5］。近年來，由于野生寬葉纈草供不應求，引種栽培成為市場上寬葉纈草的主要來源之一，但是，貴州纈草自人工栽培以來，普遍存在品種退化、產油率降低的問題。在前期的黔產寬葉纈草RAPD遺傳多樣性的分析研究中，發(fā)現貴州省不同地域栽培的寬葉纈草與野生寬葉纈草基因組DNA之間具有明顯的差異，統(tǒng)計分析也表明黔產寬葉纈草的變異與地域有關，地域差異和生長環(huán)境的不同，可能導致栽培寬葉纈草的遺傳信息發(fā)生了改變，最終導致其基因變異。

反向簡單重復序列區(qū)間多態(tài)性分子標記（Intersimple sequence repeat，ISSR）是一種在微衛(wèi)星技術基礎上創(chuàng)建起來的簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性DNA分子標記［6］。ISSR分子標記產物的多態(tài)性遠比SSR、RFLP、RAPD豐富，可以提供更加豐富的基因組信息，且精確度高、檢測非常方便、所需DNA模板的量少、操作簡單、穩(wěn)定性較高等優(yōu)點，被廣泛適用于不同物種遺傳多樣性與親緣關系的研究［7，8］。為了保證引種栽培寬葉纈草的最佳質量，探討其不同產地栽培與野生寬葉纈草遺傳相似性，為寬葉纈草資源開發(fā)和人工種植提供有參考價值的實驗依據，本研究就ISSR分子標記的反應體系進行優(yōu)化與分析，旨在找到最佳適用于黔產寬葉纈草的ISSR反應體系，為分析黔產寬葉纈草種質資源的遺傳多樣性和親緣關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用寬葉纈草由貴州省江口苗藥生物科技有限公司提供，經貴陽醫(yī)學院覃容貴教授鑒定為敗醬科纈草屬植物寬葉纈草。

DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000，北京天根生化科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、GoldViewⅠ核酸染色劑、50×TAE緩沖液等，北京索萊寶公司提供；ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的引物序列，上海生工合成。

DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；BIOMATE 3S核酸蛋白分析儀，美國thermo Fisher Scientific；S1000PCR擴增儀，美國BIO-RAD；凝膠成像儀，香港Gene Company Limited。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 以寬葉纈草嫩葉為材料，采用試劑盒法提取基因組DNA；核酸蛋白分析儀檢測純度及濃度；0.8%瓊脂糖電泳檢測完整性；提取原液-20℃保存，用于PCR反應體系的優(yōu)化試驗。

1.2.2 單因素試驗 參考相關文獻［9，10］，確定寬葉纈草初始ISSR反應體系：總體積25 μL，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.24 mmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.25U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補齊；單因素試驗時，采用變化單一因素，其他因素不變的方法，以確定該因素對ISSR結果的影響［11］，每個因素設置10個梯度濃度水平，見表1。PCR反應程序：94℃預變性5 min；然后按94℃變性30 s，55.6℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。選擇預試驗中擴增效果較好的引物UBC807，對寬葉纈草基因組 DNA 進行ISSR擴增，PCR產物于1.8%瓊脂糖凝膠上，100 V恒壓電泳1 h，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

表1 ISSR單因素試驗條件設計

1.2.3 正交試驗 根據單因素試驗結果，確定因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶為正交試驗因子，并選擇各因素有效的擴增范圍，采用L16（45）正交試驗設計，以直觀法、極差法及方差法相結合的統(tǒng)計分析方式（表2）考察各因素間的相互作用對反應體系的影響，確定寬葉纈草最佳ISSR反應體系。反應體系與擴增程序沿用單因素試驗所用條件。

表2 ISSR正交試驗水平

表3 ISSR正交試驗計劃表

1.2.4 退火溫度及引物的篩選 以最佳ISSR反應體系，引物Tm±5℃的梯度擴增模式［12］，自動生成以引物Tm值為中心的10個梯度退火溫度，從中確定最佳退火溫度。在對引物退火溫度篩選的同時，從50條候選ISSR引物中篩選出穩(wěn)定的、多態(tài)性好的寬葉纈草ISSR引物。

1.2.5 反應體系穩(wěn)定性檢測 以最佳ISSR反應體系為基礎，采用UBC807引物對9份不同地區(qū)的寬葉纈草樣品進行擴增，檢測反應體系的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 基因組DNA的質量檢測

核酸蛋白分析儀檢測所提寬葉纈草基因組DNA，OD260/280比值在1.70-1.90之間，純度較好，濃度在50.00-85.00 μg/mL之間；瓊脂糖電泳檢測結果（圖1）顯示，DNA的主帶清晰明亮，無降解現象，點樣孔無雜質，即基因組DNA的完整性較好。結果說明所提樣本DNA可用于ISSR體系的構建及后續(xù)的試驗。

圖1 DNA檢測電泳圖

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 DNA模板濃度對反應體系的影響 模板DNA的濃度設置在10-100 ng/25 μL，共10個梯度，從圖2可觀察，所擴增出的條帶在清晰度與條帶數上達到一致，并無明顯的變化，即模板DNA的濃度在10-100 ng/25 μL之間時，對寬葉纈草ISSR反應體系無明顯影響，故DNA模版濃度的大小在正交試驗中不予作為考察對象。

圖2 DNA濃度對ISSR反應體系的影響

2.2.2 Mg2+濃度對反應體系的影響 由圖3可知，在Mg2+濃度小于1.75 mmol/L時，所擴增的條帶數較少；Mg2+濃度在1.75-2.5 mmol/L時，大部分擴增條帶穩(wěn)定、清晰、明亮；在Mg2+濃度大于2.75 mmol/L時，擴增條帶變少，且不穩(wěn)定，不清晰。Mg2+作為ISSR反應中的一個主要因素，不僅會影響Taq DNA聚合酶的活性，還能與反應體系中的dNTPs、模板DNA及引物結合，影響引物與模板的結合率，同時Mg2+濃度太高或太低都可能導致擴增不完全或無擴增。由結果可知，寬葉纈草ISSR反應體系中Mg2+的濃度在1.75-2.5 mmol/L時為最佳擴增濃度范圍。

圖3 Mg2+濃度對ISSR反應體系的影響

2.2.3 dNTPs濃度對反應體系的影響 對dNTPs的10個不同濃度分別進行了PCR擴增，如圖4所示，dNTPs在低濃度為0.12、0.16 mmol/L時，PCR的產率低，條帶亮度不足；而dNTPs的濃度在0.20-0.28 mmol/L時，條帶明亮，清晰且穩(wěn)定；當dNTPs的濃度較高為0.32-0.48 mmol/L時，未得到有效擴增，條帶少，甚至無條帶。dNTPs是ISSR擴增的原料，其濃度直接影響擴增產物的生成，dNTPs濃度不足時，DNA合成速率低，dNTPs過早耗盡而使產物單鏈化，擴增效果差；dNTPs濃度過高時，容易與Mg2+結合而降低游離Mg2+濃度，從而影響Taq DNA聚合酶的活性。dNTPs的濃度過低或過高都不能得到有效的擴增。因此，dNTPs的濃度在0.20-0.28 mmol/L為寬葉纈草ISSR反應的有效擴增濃度。

圖4 dNTP濃度對ISSR反應體系的影響

2.2.4 Taq DNA聚合酶濃度對反應體系的影響 對ISSR的Taq DNA聚合酶濃度這一單因子進行試驗，結果（圖5）顯示，當Taq DNA聚合酶的濃度在0.5 U/25 μL時，擴增出的條帶弱且少；當濃度為0.75-1.750 U時，擴增條帶數增加，條帶清晰；Taq DNA聚合酶的濃度繼續(xù)增大時，擴增條帶變得模糊，不易區(qū)分。Taq DNA聚合酶是ISSR反應的關鍵因素，用量過多時會引起非特異性擴增，有時甚至會出現比較重的背景，影響擴增結果，用量過少導致擴增產物減少；同時，它還受Mg2+濃度及dNTPs濃度大小的綜合影響。故本試驗將0.75-1.750 U/25 μL Taq DNA聚合酶濃度定為寬葉纈草ISSR反應體系的有效擴增濃度。

圖5 Taq DNA聚合酶濃度對ISSR反應體系的影響

2.2.5 引物濃度對反應體系的影響 由圖6可知，當引物濃度為0.20-0.40 μmol/L間時，為有效擴增，擴增條帶多且清晰，反之，當引物濃度過高時，擴增條帶不穩(wěn)定，條帶變模糊。實驗在確保PCR產率的前提下，確定較低引物濃度0.20-0.40 μmol/L為有效擴增引物濃度，其結果穩(wěn)定，重現性較好。

2.3 正交試驗結果與分析

2.3.1 正交直觀分析 根據5因素4水平正交設計，共有16個試驗組合，PCR擴增結果見圖3，16個組合間存在明顯差異，14號組合效果最差，沒有擴增出條帶；6號、9號和15號組合擴增出少量條帶，但部分條帶帶型不完整，不易識別，清晰度差；2號，3號、4號、5號、7號、10號、11號、13號以及16號組合擴增條帶數相對多，但條帶清晰度不高，其中2號、7號和13號組合的背景彌散嚴重；1號、8號和12號組合擴增效果相近，擴增出的條帶數最多，清晰，宜于區(qū)分，但又以8號組合效果最好，條帶較其余組合明亮。綜合以上分析，確定選用8號為最佳組合，即25 μL總體積，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，1.75 U Taq DNA聚合酶，0.3 μmol/L引物，60 ng DNA 模板，ddH2O補齊。

圖6 引物濃度對ISSR反應體系的影響

圖7 正交試驗PCR擴增結果

2.3.2 正交極差分析 在對L16（45）正交試驗的16個組合進行直觀觀察時，并根據擴增條帶的多少及強弱、清晰度及背景強度4個指標進行計分，每項4分共計16分。對統(tǒng)計結果進行極差分析，極差用R值表示，R值越大，反應因素對體系的影響就越大。根據表3的R值判斷4個因素對黔產寬葉纈草ISSR反應體系的影響大小順序為：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶；最佳因素水平組合為：Mg2+k2（2.0 mmol/L）、dNTPs k4（0.28 mmol/L）、Taq DNA聚合酶k2（1.25 U）、引物k2（0.3 μmol/L）。

2.3.3 正交方差分析 實驗數據用SPSS17.0進行方差分析，表4所示，由F值大小可知影響寬葉纈草ISSR反應體系的大小次序為：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶，與極差分析的結果相一致，其中Taq DNA聚合酶的濃度大小對反應體系的影響最小。在α=0.05水平各因素水平間的差異對擴增結果沒有達到顯著水平。

表4 寬葉纈草ISSR反應體系各因素方差分析

綜合直觀分析、極差分析與方差分析的結果，確定寬葉纈草ISSR最佳反應體系組合為正交試驗8號：2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶。

2.4 退火溫度及引物的篩選

50個候選ISSR引物以10個梯度Tm±5℃退火溫度進行擴增。結果（表5）表明，不同退火溫度的擴增帶型間具有差異，選擇重復性好、擴增條帶清晰的退火溫度為最佳退火溫度。

2.5 ISSR體系穩(wěn)定性檢測

通過對9份不同產地寬葉纈草樣品進行擴增，結果（圖8）顯示，9份樣品均得到有效擴增，擴增所得條帶清晰，即所建立的黔產寬葉纈草ISSR反應體系穩(wěn)定。

3 討論

ISSR分子標記技術建立在PCR的基礎上，受模板DNA、Taq DNA 聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs5個因素的影響［13，14］。任偉等［11］通過單因素試驗確定了朝鮮堿茅的最佳ISSR擴增反應體系，但ISSR反應體系是一個因素間相互效應的組合，僅通過單因素試驗直觀確定最佳反應體系，具有一定的不穩(wěn)定性。包蕊等［15］、歐立軍等［16］、代文娟等［17］利用正交設計分別確定了華扁穗草、天門冬及廣西火桐的ISSR最佳反應體系，正交設計可以使各因素快速的組合，確定最佳反應體系，但在因素水平的選取上存在一定的不確定性。本研究采用單因素試驗，首先確定各個因素的有效擴增濃度范圍，再通過正交試驗確定因素最佳水平組合，這種單因素試驗與正交試驗相結合的方法，不僅可以克服正交試驗因素水平的難以確定問題，還可以避免單因素試驗顧此失彼的缺點，明確、均衡、綜合性的確定各個試驗因素，以最有效的方式在最短的時間內找到最優(yōu)的試驗水平組合。目前，兩面針［14］、鎖陽［18］、陽春砂［19］等多種藥用植物利用單因素與正交設計相結合的方法，優(yōu)化得到準確穩(wěn)定的ISSR反應體系。

表5 備選的ISSR引物

圖8 9份不同產地寬葉纈草樣品擴增結果

本次實驗中，盡管正交設計的各因素的水平都是基于單因素的有效擴增濃度范圍內，但不同的組合對寬葉纈草的ISSR擴增結果影響也是比較大的，通過對擴增譜圖的直觀分析以及統(tǒng)計學的極差分析與方差分析，使分析結果相對以往的PCR反應體系優(yōu)化更科學、完善。極差分析中所確立的最佳ISSR反應體系組合，與直觀分析中所確立的最佳水平組合僅Taq DNA聚合酶的濃度不一致，但極差分析與方差分析的結果顯示，Taq DNA聚合酶濃度并不是反應體系的主要影響因素。方差分析結果顯示，各個影響因素的P值都大于0.05，說明各影響因素在水平范圍內對反應體系都存在不顯著影響，這可能是因為通過單因素試驗確立了各因素有效擴增的濃度范圍的原因。

ISSR分子標記適用于物種的遺傳多樣性分析，但不同的物種其ISSR體系也有一定的差異。單因素試驗結果表明，模板DNA濃度大小對黔產寬葉纈草ISSR的擴增影響不明顯，DNA的濃度對擴增的效果不顯著，這與吳鳴謙［20］建立的擬莖點霉最佳ISSR反應體系的結論相似。本研究同時也發(fā)現，黔產寬葉纈草ISSR擴增的因素影響大小依次是：Mg2+＞引物＞dNTPs＞Taq DNA聚合酶，而在節(jié)瓜［9］的ISSR體系研究中，認為因素dNTPs是影響最大的因子；而薰衣草［21］的ISSR優(yōu)化體系的相對影響程度從大到小依次為：Mg2+、dNTPs、引物和 DNA 濃度?；谘芯拷Y果，表明優(yōu)化黔產寬葉纈草的ISSR反應體系是十分必要的，不僅建立了專屬于黔產寬葉纈草ISSR反應體系，同時也為同種、其他來源的寬葉纈草的相關研究提供實驗依據。

在進行某物種的ISSR分子標記研究時，一個穩(wěn)定、有效的擴增體系是基礎，而適合該物種的ISSR引物就是研究的前提［16，22］。在篩選引物的工作中，退火溫度能明顯地影響擴增條帶的特異性［23］，甚至是條帶的有無，不同引物有著各自的退火溫度，因此，對不同引物退火溫度的優(yōu)化篩選是一項非常必要的工作，也是引物篩選的必要前提。本研究以優(yōu)化的最佳ISSR反應體系對50條候選引物的退火溫度進行一一篩選，以確保每一條引物擴增條帶穩(wěn)定，重現性好并且清晰，同時通過ISSR體系的驗證試驗，為應用ISSR分子標記技術進行黔產寬葉纈草的遺傳多樣性研究奠定技術基礎。

4 結論

在單因素實驗中，確立了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶這5個主要影響黔產寬葉纈草ISSR擴增的有效濃度范圍，并在此基礎上通過正交設計實驗得到適合寬葉纈草的ISSR反應體系：總體積25 μL，包含2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.75 U Taq DNA聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O補齊。所建立的ISSR反應體系適用于黔產寬葉纈草的ISSR擴增。

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（責任編輯 狄艷紅）

Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Valeriana officinalis L. var. latifolia Miq of Guizhou Province

Qian Zhiyao Zhou Daotang Huang Xiuping Zhou Mei Chen Zuyun Qin Ronggui
（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025）

This study is to establish a stable and reliable ISSR system for Valeriana officinalis L.var. latifolia Miq. Based on the single factor experiment in 10 levels， L16（45）orthogonal design was applied to conduct combinatorial optimization in 4 levels of 4 major factors，and the results were analyzed by visual method， range analysis and variance method. The primer and the optimal annealing temperature were screened by optimized reaction system. The stability and reliability of this system were tested by 9 samples from different origins. The optimal ISSR conditions in the experiments were as following： in 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×Taq Buffer， 2.0 mmol/L Mg2+， 0.28 mmol/ L dNTPs， 0.3 μmol/L primer， 1.75 U Taq DNA polymerase， 60 ng DNA template， and ddH2O completed. The order of the effect by the factors was in Mg2+＞ primer ＞ dNTP s ＞ Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature for each primer was determined， and 17 primers with distinct and stable amplified bands were screened. Stability test showed that the optimized system was stable and reliable. By this study we may reach the conclusion that the optimal ISSR reaction system for V. officinalis var. latifolia was generated， and the desired primers also were screened， which may provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology in the study of genetic diversity of V. officinalis var. latifolia.

Valeriana officinalis L. var. latifolia Miq；ISSR；single factor experiment；orthogonal design；optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.011

2015-02-03

貴州省中藥攻關項目（黔科合ZY［2011］3008號），貴州省高層次人才特助經費（TZJF-2010-053號）

錢志瑤，女，碩士研究生，研究方向：中藥資源及質量評價；E-mail：15285135995@163.com

覃容貴，女，博士，教授，研究方向：中藥資源及質量評價；E-mail：1346812934@qq.com