井趙斌雷玉山李永武

（1.陜西省農(nóng)村科技開(kāi)發(fā)中心，西安 710054；2.陜西省西安獼猴桃試驗(yàn)站，西安 710054；3.陜西省漢中獼猴桃研究所，漢中 723500）

生物技術(shù)與我國(guó)獼猴桃育種

井趙斌1，3雷玉山1，2，3李永武2，3

（1.陜西省農(nóng)村科技開(kāi)發(fā)中心，西安 710054；2.陜西省西安獼猴桃試驗(yàn)站，西安 710054；3.陜西省漢中獼猴桃研究所，漢中 723500）

獼猴桃是原產(chǎn)我國(guó)的重要果樹(shù)之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，以野生和實(shí)生選優(yōu)為主的傳統(tǒng)獼猴桃育種方法與以基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因?yàn)楹诵牡姆肿佑N技術(shù)相比，挑戰(zhàn)和機(jī)遇并存。與其他果樹(shù)相比，獼猴桃生物技術(shù)及其轉(zhuǎn)基因研究較為滯后。就現(xiàn)代生物技術(shù)在獼猴桃遺傳育種中的方法、應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)我國(guó)獼猴桃育種現(xiàn)狀進(jìn)行淺析，旨在為我國(guó)獼猴桃育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供方法參考及思路借鑒。

獼猴桃；基因組；轉(zhuǎn)基因；育種

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）是原產(chǎn)我國(guó)的重要果樹(shù)資源，以其獨(dú)特的風(fēng)味，富含維生素C、膳食纖維、多種礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分而成為重要的水果之一［1］。獼猴桃隸屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)表明，該屬共有55種，共約76個(gè)分類單元［2］。

以野生和實(shí)生表型鑒定、選擇，以芽變和雜交等傳統(tǒng)育種方法培育新品種已有較長(zhǎng)的歷史，并將繼續(xù)在獼猴桃育種中占居不可替代的地位。目前，以基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的生物技術(shù)為獼猴桃育種開(kāi)辟了新的途徑。本文主要對(duì)獼猴桃生物技術(shù)研究進(jìn)展及其在獼猴桃育種和種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為我國(guó)獼猴桃育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考思路。

1 獼猴桃生物技術(shù)研究進(jìn)展

1.1 基因組學(xué)在獼猴桃研究中的應(yīng)用

1.1.1 基因組資源 通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）測(cè)序發(fā)掘基因產(chǎn)生了大量的基因組資源。Crowhurst等［3］基于中華獼猴桃（A. chinensis）、軟棗獼猴桃（A. arguta）、毛花獼猴桃（A. eriantha）和美味獼猴桃（A.deliciosa）開(kāi)發(fā)了控制風(fēng)味、色澤、營(yíng)養(yǎng)成分和成熟性狀的ESTs序列共132 577條。截止到2015年7月7日，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中可以檢索到與獼猴桃相關(guān)的ESTs和核苷酸序列共193 221條，這些序列主要是基于中華獼猴桃、刺毛獼猴桃（A. setosa）、美味獼猴桃、毛花獼猴桃、軟棗獼猴桃、長(zhǎng)葉獼猴桃（A.hemsleyana）和葛棗獼猴桃（A. polygama）開(kāi)發(fā)的，其中以果實(shí)、葉片、花瓣和葉芽組織居多。基于ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)了許多分子標(biāo)記，如Zhou等［4］基于中華獼猴桃ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)發(fā)了15個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）標(biāo)記，并利用酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphism sequence，CAPS）方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明這些標(biāo)記可用于獼猴桃自然群體的遺傳變異和進(jìn)化研究。

1.1.2 分子標(biāo)記 分子標(biāo)記已被成功的應(yīng)用于獼猴桃屬物種遺傳學(xué)研究中，其主要作用表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是在對(duì)種間和種內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上通過(guò)系統(tǒng)雜交提高種質(zhì)資源的利用效率；二是對(duì)雜交后代進(jìn)行輔助選擇育種。目前，已有許多分子標(biāo)記技術(shù)用于獼猴桃研究中，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、 隨 機(jī) 擴(kuò) 增 多 態(tài) 性（Random amplified polymorphic，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間多態(tài)性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）、簡(jiǎn) 單 重 復(fù) 序 列（Simple sequence repeat，SSR）、SNP［5-15］。分子標(biāo)記在獼猴桃研究中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）遺傳多樣性研究。遺傳多樣性分析既是人工選擇進(jìn)行群體改良的基礎(chǔ)，又是對(duì)各種環(huán)境條件下最優(yōu)群體進(jìn)行分子鑒定的方法，可以為后續(xù)雜交親本選擇提供物種遺傳信息［16］。Crowhurst等［5］用RFLP標(biāo)記分析了4個(gè)獼猴桃種的親緣關(guān)系，結(jié)果表明中華獼猴桃和美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，而與毛花獼猴桃和闊葉獼猴桃（A.latifolia）關(guān)系較遠(yuǎn)。Palombi等［17］首次比較了RAPD和SSR標(biāo)記在微繁美味獼猴桃植株遺傳變異中應(yīng)用效果。Korkovelos等［18］研究發(fā)現(xiàn)僅用一個(gè)SSR位點(diǎn)就可以區(qū)分13個(gè)不同基因型的中華獼猴桃。Zhen等［15］利用9個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)48個(gè)獼猴桃栽培品種進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。Korkovelos等［13］利用8個(gè)獼猴桃種對(duì)SSR標(biāo)記的有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)二核苷酸序列多帶性最高。Mavromatis等［19］利用SSR標(biāo)記對(duì)新選育的獼猴桃新品種進(jìn)行了分子指紋識(shí)別分析。（2）連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位。Testolin等［9］利用SSRs和AFLP標(biāo)記結(jié)合雙假測(cè)交作圖策略基于中華獼猴桃和硬齒獼猴桃（A.collosa）種間雜交群體構(gòu)建了第一張獼猴桃連鎖圖譜。Fraser等［20］利用644個(gè)SSRs標(biāo)記構(gòu)建了包括29條染色體的中華獼猴桃連鎖圖譜，該圖譜是利用來(lái)源于二倍體中華獼猴桃種間雜交的272個(gè)個(gè)體植株構(gòu)建的。Novo等［14］基于RAPD和AFLP標(biāo)記對(duì)41株雄花獼猴桃植株花期進(jìn)行了分析，找到了可用于雄花粉植株選擇育種的特異性標(biāo)記片段。湯佳樂(lè)等［21］以抗壞血酸（AsA）含量變異豐富的野生毛花獼猴桃種群為材料，對(duì)其葉片和果實(shí)中的AsA含量與SSR標(biāo)記進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，獲得了5個(gè)優(yōu)異的SSR標(biāo)記位點(diǎn)。

雖然分子標(biāo)記用于果樹(shù)育種的報(bào)道已很多，但與育種實(shí)踐尚有很大的差距。分子標(biāo)記輔助選擇育種是許多研究者對(duì)育種工作的設(shè)想，但從目前現(xiàn)狀來(lái)看，對(duì)于獼猴桃育種要付之實(shí)踐需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。我國(guó)分子育種具體存在兩大問(wèn)題：一是育種者對(duì)分子標(biāo)記的認(rèn)識(shí)不充分，沒(méi)有真正理解其作用；二是標(biāo)記開(kāi)發(fā)數(shù)量少、標(biāo)記與育種目標(biāo)不匹配，缺乏為獼猴桃育種服務(wù)的分子技術(shù)平臺(tái)。隨著首個(gè)獼猴桃品種紅陽(yáng)基因組測(cè)序的完成，分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的進(jìn)程將大大加快，預(yù)計(jì)會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)獼猴桃新品種選育的步伐。

1.1.3 功能基因組和基因組測(cè)序 Richardson等［22］用基因表達(dá)分析方法研究獼猴桃Hort16A從開(kāi)花到果實(shí)成熟的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程，結(jié)果表明果實(shí)形態(tài)和生長(zhǎng)與模式水果番茄相似，僅在果實(shí)成熟過(guò)程中存在很大差別。Varkonyi-Gasic等［23］以“Hort16A”為材料研究了獼猴桃花期基因表達(dá)情況，明確了獼猴桃花發(fā)育的整個(gè)分子機(jī)理。黃春輝等［23］利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了中華獼猴桃“金豐”的黃肉色澤變化機(jī)理，并結(jié)合數(shù)字基因表達(dá)譜（Digital gene expression，DGE）比較分析黃肉獼猴桃在轉(zhuǎn)色前期、轉(zhuǎn)色期和后期的基因表達(dá)差異性。Huang等［25］以中華獼猴桃“紅陽(yáng)”為材料，利用IIIumina Hiseq2000高通量測(cè)序方法并結(jié)合SLAF-seq技術(shù)，完成了世界首個(gè)獼猴桃基因組測(cè)序組裝工作，獲得140X覆蓋度，通過(guò)包含4 301個(gè)SLAF標(biāo)記的高密度遺傳圖譜輔助scaffold序列組裝到29個(gè)染色體上，獲得基因組大小為616.1 Mb，共有39 040個(gè)基因。該測(cè)序成果的發(fā)表為其他獼猴桃物種的基因組測(cè)序提供了參考基因組信息，同時(shí)可研究種間變異和開(kāi)發(fā)新的SNPs。

1.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在獼猴桃育種中的應(yīng)用

常規(guī)育種方法進(jìn)行獼猴桃育種周期較長(zhǎng)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種可以縮短育種時(shí)間。獼猴桃轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究應(yīng)用主要集中在組織培養(yǎng)技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化體系及植株再生等方面。

1.2.1 組織培養(yǎng)技術(shù)

1.2.1.1 外植體增殖 Harada等［26］首次報(bào)道了利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行獼猴桃增殖的研究，隨后有許多學(xué)者基于不同外植體和基因型也進(jìn)行了研究［27-29］。最常用的增殖培養(yǎng)基是MS。此外，還有Gamborg B5培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基［27，30］。增殖一般包括3個(gè)主要流程：首先是用0.5%-1.5%的次氯酸鈉進(jìn)行外植體消毒；第二是在MS培養(yǎng)基上利用外植體（如芽、結(jié)面和幼葉）進(jìn)行莖端增殖，MS培養(yǎng)基中包括2%-3%的蔗糖，0.1-1.0 mg/L的玉米素，0.01-0.1 mg/L的萘乙酸（NAA），0.7的瓊脂，pH值為5.8；最后是在包含0.5-1.0 mg/L吲哚乙酸（IBA）的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。一般條件是在24±2℃培養(yǎng)16 h，光照強(qiáng)度為20-30 μmol/m2/s。研究表明，莖端增殖速率的變化主要取決于物種、外植體類型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)條件［29］。例如，Kim等［29］利用海沃德800 μm或1 200 μm的橫薄切片外植體經(jīng)過(guò)7周獲得了2.61倍的增值速率，其培養(yǎng)基為包含了3%蔗糖，4.5×10-3μmol/L的2，4-D，4.6×10-1μmol/L玉米素和0.8%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基，pH值為5.8。

1.2.1.2 原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交 雌雄異株和多倍體特性為獼猴桃常規(guī)育種帶來(lái)不便，體細(xì)胞雜交技術(shù)為不同遺傳背景或克服種間雜交不親和性提供了可能。體細(xì)胞雜交一般通過(guò)原生質(zhì)體融合實(shí)現(xiàn)。目前，已有從不同獼猴桃基因型和物種的愈傷組織、懸浮培養(yǎng)液、葉片葉肉和子葉獲得原生質(zhì)體的報(bào)道［31-33］。如Xiao和Han［31］成功獲得中華獼猴桃和美味獼猴桃的原生質(zhì)體；Zhang等［32］從體外培養(yǎng)毛花獼猴桃幼苗的新生葉片上分離獲得了原生質(zhì)體；Xiao等［33］報(bào)道了分別從中華獼猴桃愈傷組織子葉和狗棗獼猴桃葉肉細(xì)胞獲得原生質(zhì)體的結(jié)果。

1.2.1.3 其他培養(yǎng)技術(shù)：其他組織培養(yǎng)技術(shù)主要包括胚挽救、胚乳培養(yǎng)、體外染色體加倍等［34-37］。例如，Mu等［38］利用胚挽救技術(shù)成功將二倍體中華獼猴桃和四倍體黑蕊獼猴桃雜交后代胚轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)。Hirsch等［36］進(jìn)行了不同獼猴桃種和倍性的雜交（包括狗棗獼猴桃（A.lolomikta）×中華獼猴桃、葛棗獼猴桃×對(duì)萼獼猴桃（A.valvata）、軟棗獼猴桃×葛棗獼猴桃、狗棗獼猴桃×美味獼猴桃），利用胚挽救技術(shù)獲得了這些雜交組合的植株苗。陳緒中等［34］利用胚珠培養(yǎng)技術(shù)成功獲得中華獼猴桃×狗棗獼猴桃種間雜交的雜交后代植株苗。Mu等［35］利用胚培養(yǎng)技術(shù)從種間雜交（中華獼猴桃×黑蕊獼猴桃（A.melanandra）、軟棗獼猴桃×黑蕊獼猴桃、軟棗獼猴桃×美味獼猴桃）F1和F2代種子胚成功的誘導(dǎo)形成了愈傷組織。低溫保存技術(shù)是一種可以長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源的技術(shù)在獼猴桃中也有報(bào)道［39-42］。如徐小彪等［39］將預(yù)先經(jīng)過(guò)MS培養(yǎng)基（包括5% 二甲亞砜和5% 蔗糖）培養(yǎng)4 d、然后通過(guò)PVP2溶液（30% 甘油、15% 二甲亞砜、15% PEG和13.7% 蔗糖）在0℃脫水40 min的莖尖（該莖尖從一株矮小中華獼猴桃基因型體外培養(yǎng)獲得）轉(zhuǎn)移到液氮中保存，除霜后成活率達(dá)到了56.7%。

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系 自Matsuta等［43］首次報(bào)道了轉(zhuǎn)基因獼猴桃植株以來(lái)，已有許多不同異源基因被轉(zhuǎn)化到獼猴桃的研究結(jié)果發(fā)表。這些基因主要包括：大豆β-1，3內(nèi)切葡聚糖酶基因［44］、水稻OSH1同源框基因［45］、葡萄氏合成酶基因［46］、調(diào)節(jié)獼猴桃葉黃素和β-胡蘿卜素含量的香葉基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、β-胡蘿卜素脫氫酶［47］、提高獼猴桃抗病性和抗旱性的擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因［48］。目前，應(yīng)用于獼猴桃基因轉(zhuǎn)化的方法較多，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法為主。

1.2.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 該方法有利于轉(zhuǎn)基因低拷貝數(shù)目整合到植物基因組。目前已有幾個(gè)獼猴桃種遺傳轉(zhuǎn)化體系被報(bào)道，包括中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃、毛花獼猴桃、葛棗獼猴桃和狗棗獼猴桃，這些轉(zhuǎn)化體系主要用的植物外植體組織包括葉片、莖、葉柄、根、子葉下軸和原生質(zhì)體［49-52］。用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的菌株主要包括農(nóng)桿菌LBA4404、A281、C58、EHA101和EHA105。目前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法發(fā)表的幾個(gè)獼猴桃種轉(zhuǎn)化體系，見(jiàn)表1。

表1 基于不同獼猴桃種建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系

1.2.2.2 基因槍法 該方法是一種將外源DNA包被在金粉或鎢粉微粒表面，在高壓作用下轟擊受體細(xì)胞或組織而達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法［16］。Qiu等［62］報(bào)道了利用基因槍法成功將CaMV 35S轉(zhuǎn)錄DHN1基因?qū)氲矫牢东J猴桃懸浮細(xì)胞中。在獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化中，也有利用PEG介導(dǎo)法的成功報(bào)道，朱道圩等［63］成功的利用該方法將綠色熒光蛋白基因（GFP）轉(zhuǎn)入到了軟棗獼猴桃原生質(zhì)體中。成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的一個(gè)基本條件是選擇的植物細(xì)胞類型或者外植體可區(qū)分整個(gè)植株。研究表明，幼葉、葉柄和莖尖組織已被成功用于獼猴桃轉(zhuǎn)化中。一般情況下選擇的外植體越幼嫩更容易獲得再生植株，而Han等［51］在軟棗獼猴桃研究中發(fā)現(xiàn)，如果選擇太幼嫩的外植體，農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)壞死和褐變現(xiàn)象。因此，有研究者提出要保持獼猴桃外植體在農(nóng)桿菌共培養(yǎng)條件下的活性和耐性，每3-4周進(jìn)行體外繼代培養(yǎng)必不可少［60］。MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基也被成功的用于獼猴桃愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生［28］。植物生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素的使用主要取決于外植體材料。例如，F(xiàn)raser等［54］研究發(fā)現(xiàn)在中華獼猴桃組織再生中，加入0.1 mg/L的噻苯?。═DZ）和10 mg/L的激動(dòng)素再生效果要明顯優(yōu)于其他細(xì)胞分裂素。Wang等［60］研究發(fā)現(xiàn)在加入了2 mg/L玉米素和3 mg/L的BAP培養(yǎng)基中，可以獲得更高的毛花獼猴桃再生芽。Kim等［47］利用包含0.001 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L玉米素的1/2MS培養(yǎng)基獲得了美味獼猴桃再生芽。

2 獼猴桃育種進(jìn)展及其方法

2.1 獼猴桃育種主要進(jìn)展

據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2013年，全球獼猴桃面積約為17萬(wàn)hm2，產(chǎn)量242.80萬(wàn)t（數(shù)據(jù)引自第八屆國(guó)際獼猴桃會(huì)議資料）。從1978-2013年，我國(guó)獼猴桃種植面積從不足1 hm2增加到了11萬(wàn)hm2，截止到2013年我國(guó)獼猴桃年產(chǎn)量達(dá)到約123.63萬(wàn)t。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明由于育種家的多年努力，獼猴桃主產(chǎn)國(guó)的栽培面積和產(chǎn)量在繼續(xù)提高。我國(guó)獼猴桃育種取得的新進(jìn)展主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：（1）主栽區(qū)育成一批優(yōu)良的新品種，實(shí)現(xiàn)了國(guó)外品種長(zhǎng)期主導(dǎo)我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的局面。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，主要美味獼猴桃品種有（陜西）秦美、（湖南）米良1號(hào)、（湖北）金魁、（江蘇）徐香、（貴州）貴長(zhǎng)、（陜西）翠香、（河南）華美2號(hào)、（陜西）金香、金碩（湖北）、（湖北）鄂獼猴桃4號(hào)、（河南）中獼1號(hào)、（安徽）皖翠、（陜西）秦翠、（四川）川獼1號(hào)、川獼2號(hào)、（河南）蜜寶1號(hào)。主要中華獼猴桃品種有（湖北）金桃、（四川）紅陽(yáng)、（陜西）華優(yōu)、（湖北）金艷、（湖南）翠玉、（湖南）豐悅、（江西）早鮮、（江西）魁蜜、（江西）金豐、（湖南）楚紅、（湖北）武植3號(hào)、（四川）金什1號(hào)、（湖北）金怡、（湖北）鄂獼猴桃3號(hào)、（湖北）金早、（湖北）鄂獼猴桃3號(hào)、（湖北）金陽(yáng)1號(hào)、金農(nóng)1號(hào)及（四川）川獼3號(hào)和川獼4號(hào)。主要雄性授粉品種有（新西蘭）湯姆利、（新西蘭）馬圖阿、（湖北）磨山4號(hào)及（湖北）超紅。其他種獼猴桃品種有：毛花獼猴桃品種‘華特’、軟棗獼猴桃新品種‘寶貝星’（四川）、黑蕊獼猴桃新品種‘紅寶石星’（河南）和大籽獼猴桃新品種‘金鈴’（湖北）。在我國(guó)大面積栽培的國(guó)外品種有海沃德（新西蘭）、布魯諾（新西蘭）、Hort16A（新西蘭）［1，64，65］。自1978年以來(lái)我國(guó)選育出了近100多個(gè)獼猴桃優(yōu)良品種（品系），實(shí)際上大面積推廣栽培的品種很少。截止到2011年，栽培面積占到全國(guó)5%的品種僅有紅陽(yáng)、徐香、秦美和金魁4個(gè)［1］?？傮w來(lái)說(shuō)，大面積推廣栽培的品種主要表現(xiàn)是產(chǎn)量和品質(zhì)較高，而最突出的特點(diǎn)是生態(tài)適應(yīng)性廣。（2）育種目標(biāo)趨于多元化發(fā)展。例如，傳統(tǒng)的獼猴桃以綠肉果實(shí)為主，近年來(lái)黃肉和紅肉獼猴桃逐漸受到消費(fèi)者青睞，用中華獼猴桃和毛花獼猴桃雜交育成的黃肉品種‘金艷’已經(jīng)成功進(jìn)入歐洲和南美市場(chǎng)；另外，也培育了供觀賞的品種，如‘江山嬌’和‘滿天星’［66］。

獼猴桃育種中還存在許多較為突出的問(wèn)題?？傮w上可以概括為：育種單位多，組織形式不合理，缺乏有效協(xié)作和必要的合作，材料和信息交流不暢通，嚴(yán)重影響了我國(guó)獼猴桃大品種和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平。具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是育種方法和品種單一。目前我國(guó)育成的這100多個(gè)新品種（系）中，約有95%以上的品種是通過(guò)野生、實(shí)生選優(yōu)方法育成的；另外，這些品種中基本上以美味獼猴桃和中華獼猴桃為主，涉及到其他獼猴桃種的很少。二是生物技術(shù)應(yīng)用慢，針對(duì)特定性狀的分子標(biāo)記很少，分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與獼猴桃育種目標(biāo)結(jié)合不緊密，尚未建立起為育種服務(wù)的生物技術(shù)平臺(tái)，標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)沒(méi)有真正在新品種培育中發(fā)揮作用。三是新品種審定應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范化。近30多年來(lái)全國(guó)共育成審定品種數(shù)量很多，但大多數(shù)品種基本上都是處于“曇花一現(xiàn)”的困窘，真正能夠在生產(chǎn)上推廣栽培的品種寥寥無(wú)幾；另外，這些審定的品種中對(duì)抗病性（特別是抗?jié)儾。┑然旧隙既狈﹁b定結(jié)果，直接影響了品種的推廣壽命。

2.2 育種方法和育種路線淺析

現(xiàn)有的獼猴桃育種方法主要有：野生選優(yōu)、實(shí)生選優(yōu)、芽變選種、雜交育種和漸滲育種等［1］。現(xiàn)階段，我國(guó)獼猴桃育種仍然以野生選優(yōu)和實(shí)生選優(yōu)為主，利用這些方法培育出的品種為推動(dòng)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)，如秦美、金魁和金桃等；通過(guò)實(shí)生選優(yōu)培育的品種有海沃德、紅陽(yáng)、徐香和華優(yōu)等；也有經(jīng)過(guò)種間雜交育成的品種，如金艷［64］。野生和實(shí)生選優(yōu)存在育種周期長(zhǎng)，同時(shí)是建立在大量野生資源收集基礎(chǔ)上的。因此，如何將野生和實(shí)生選優(yōu)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，加速育種進(jìn)程和定向性是急需解決的一個(gè)問(wèn)題。另外，種間雜交在獼猴桃育種中應(yīng)用也較多，該方法可以將感興趣的野生物種農(nóng)藝性狀通過(guò)雜交轉(zhuǎn)育到栽培品種中［67，68］。目前已有許多獼猴桃實(shí)現(xiàn)了種間雜交育種，主要包括中華獼猴桃、軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃、大籽獼猴桃（A.macrosperma）和狗棗獼猴桃等［36，38，67-75］。某些物種雜交后代雖然由于受精障礙無(wú)法獲得可育種子，但在獼猴桃種間雜交中已成功獲得了一些優(yōu)良性狀，如實(shí)現(xiàn)了紅色和黃色果肉、高含量VC、綠色和無(wú)毛果皮、高含量的可溶性固形物、花結(jié)構(gòu)和顏色［67，68，70，71］。例如，Hirsch等［36］配置了4個(gè)種間雜交組合：狗棗獼猴桃×中華獼猴桃、葛棗獼猴桃×對(duì)萼獼猴桃、軟棗獼猴桃×葛棗獼猴桃、狗棗獼猴桃×美味獼猴桃，流式細(xì)胞分析檢測(cè)結(jié)果表明在這些物種間存在廣泛的種間可雜交性。近年來(lái)，利用體外染色體加倍技術(shù)進(jìn)行育種的研究也有報(bào)道。如Wu等［37］利用秋水仙素離體加倍中華獼猴桃染色體進(jìn)行育種，這是首次成功的將秋水仙素用于獼猴桃多倍體誘導(dǎo)育種研究中，結(jié)果表明加倍效率主要受體外培養(yǎng)基和秋水仙素濃度的相互作用。Wu等［76］報(bào)道了自然四倍體和人工誘導(dǎo)四倍體中華獼猴桃染色體減數(shù)分裂中的配對(duì)行為，指出二倍體種質(zhì)資源可用于四倍體獼猴桃育種中。也有利用其他方法培育新品種的報(bào)道，如Mavromatis等［19］從獼猴桃品種“海沃德”中利用系統(tǒng)的孢子體選擇方法選育出了一個(gè)新品種。

合理科學(xué)的育種理論和方法對(duì)指導(dǎo)獼猴桃育種工作具有重要的意義。基于現(xiàn)階段相關(guān)研究進(jìn)展，我國(guó)獼猴桃的育種方法可以分為：傳統(tǒng)育種和現(xiàn)代育種。（1）傳統(tǒng)育種即選擇具有特定性狀的雜交親本進(jìn)行人工雜交育種以培育具有某種新性狀的優(yōu)良品種或者經(jīng)過(guò)野生選優(yōu)和實(shí)生選優(yōu)培育新品種，如Atkinson等［77］對(duì)毛花獼猴桃利于剝皮的這一特性進(jìn)行了分析，并將其用于常規(guī)雜交育種實(shí)踐中；（2）現(xiàn)代育種，也可稱為快速育種技術(shù)，主要是利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇育種，并借助生物統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行親本、后代的有效選擇和評(píng)價(jià)基因型和環(huán)境相互作用的影響，如黃宏文［1］提出的獼猴桃基因漸滲育種就是現(xiàn)代育種技術(shù)的一個(gè)范例。如在自然資源不具優(yōu)勢(shì)的新西蘭和意大利等獼猴桃主產(chǎn)國(guó)，其新品種選育大多采用了大量的人工雜交設(shè)計(jì)育種程序和分子標(biāo)記輔助選擇育種［1］。例如，Gill等［8］利用RAPD分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)了用于獼猴桃性別決定鑒定的序列特異性擴(kuò)增區(qū)（Sequence-characterized amplified region，SCAR）標(biāo)記，這些標(biāo)記可以用于獼猴桃標(biāo)記輔助育種選擇中，如對(duì)雜交后代在苗期剔除雄株，當(dāng)作為授粉樹(shù)時(shí)用于選擇雄株，或者用于確定種植群體的一個(gè)合理的雌雄子代比率。

從育種路線上可以分為：抗逆育種、品質(zhì)育種和砧木選擇育種等。（1）抗逆育種具體包括抗病、抗旱、抗寒和抗熱等育種；（2）品質(zhì)育種主要包括果實(shí)大小和形狀、果面毛被、果肉顏色、果實(shí)質(zhì)地、果實(shí)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分等。

基于以上育種方法體系，適應(yīng)于我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的育種策略和育種目標(biāo)可以概括描述為：“以獼猴桃野生種質(zhì)資源收集和評(píng)價(jià)為中心，通過(guò)傳統(tǒng)育種和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，培育滿足消費(fèi)者和市場(chǎng)需求的具有新性狀的優(yōu)良品種為目標(biāo)”。 在具體育種實(shí)踐中可考慮利用的現(xiàn)代技術(shù)包括：染色體重組調(diào)控、細(xì)胞選擇、原生質(zhì)體融合、倍性操作和胚胎培養(yǎng)等（www.plantandfood.co.nz）。此外，新一代測(cè)序技術(shù)如轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和SLAF-seq技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)的研究發(fā)揮了巨大的作用，我國(guó)獼猴桃野生資源豐富，利用新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行各種優(yōu)異資源開(kāi)發(fā)，建立大規(guī)模的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，可加速育種進(jìn)程，為培育轉(zhuǎn)基因新品種提供豐富的基因資源［78，79］。

3 展望

獼猴桃因其富含豐富的營(yíng)養(yǎng)，已成為人們青睞的水果。而優(yōu)質(zhì)的獼猴桃新品種是實(shí)現(xiàn)其高品質(zhì)的保證。因此，針對(duì)重要性狀的多目標(biāo)育種應(yīng)是今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的重要任務(wù)。

3.1 加強(qiáng)我國(guó)野生獼猴桃種質(zhì)資源的收集、鑒定、評(píng)價(jià)和利用

野生種質(zhì)資源中包含著豐富的優(yōu)異基因，是一個(gè)巨大的天然“基因庫(kù)”，也是新品種選育的主要材料來(lái)源。目前主栽的獼猴桃品種基本上都是利用野生資源選育的，如海沃德和秦美。獼猴桃野生種質(zhì)資源可以考慮從以下幾個(gè)方面著手開(kāi)展工作：一是加強(qiáng)野外資源調(diào)查工作。野生種質(zhì)資源調(diào)查應(yīng)是育種工作者堅(jiān)持的一項(xiàng)常規(guī)性工作，當(dāng)前更多的青年研究者熱衷于從事實(shí)驗(yàn)室和分子研究工作，而往往忽視了野生資源的收集與利用；二是加強(qiáng)開(kāi)展野生資源多目標(biāo)評(píng)價(jià)篩選和優(yōu)異基因的發(fā)掘。對(duì)野生資源的利用不能僅僅局限于品種選育方面，如在以往的抗逆性資源篩選和轉(zhuǎn)基因研究中，選擇的研究材料多集中在栽培品種中，將抗逆資源篩選和抗逆基因發(fā)掘的重點(diǎn)放在野生植物上更為可行，因?yàn)檫@方面的抗逆資源更為豐富、抗性更強(qiáng)，而且與栽培品種相比，這類野生植株存活需求是第一位的，產(chǎn)量品質(zhì)是第二位的，生態(tài)生理效益在先，只要生存下來(lái)，就有機(jī)會(huì)實(shí)現(xiàn)其栽培經(jīng)濟(jì)目標(biāo)。具體來(lái)說(shuō)，在獼猴桃研究中，可從野生資源中鑒定篩選抗旱、抗寒砧木，利用抗獼猴桃潰瘍病材料進(jìn)行抗性基因發(fā)掘，為培育轉(zhuǎn)基因品種奠定夯實(shí)的材料基礎(chǔ)。

3.2 加強(qiáng)獼猴桃特異資源的種質(zhì)創(chuàng)新

通過(guò)植物基因工程、種間雜交、胚挽救和花藥培養(yǎng)等方法可以實(shí)現(xiàn)新種質(zhì)創(chuàng)新。特別是以獼猴桃野生近緣種為供體，與栽培品種雜交，同時(shí)利用“高代回交法”，可以將近緣種中的優(yōu)異目標(biāo)基因快速轉(zhuǎn)移到栽培種中。目前，獼猴桃分子研究的目標(biāo)性狀多集中在果實(shí)風(fēng)味、香味、成熟和顏色上；另外，由于潰瘍病的大面積爆發(fā)，近年來(lái)在獼猴桃潰瘍病方面的研究也越來(lái)越多，而對(duì)抗逆性狀的研究相對(duì)較少。另外，獼猴桃雄性授粉品種特異資源的培育也是一個(gè)研究重點(diǎn)，利用野生資源進(jìn)行雄性品種選育需要注意幾個(gè)問(wèn)題：一是選擇樹(shù)體健壯，花量大，花母枝開(kāi)花數(shù)量多，每朵花含有的花粉粒多，花粉發(fā)芽率高，花期長(zhǎng)的資源；二是選擇多種倍性的雄株，以保證與雌性品種的配套，并開(kāi)展多種雄花與栽培品種的花粉直感效應(yīng)研究，為生產(chǎn)上栽培品種提供最優(yōu)的配套雄株；三是在篩選獼猴桃主栽品種專用授粉雄株的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)花粉加工專用設(shè)備組裝形成生產(chǎn)線，建設(shè)花粉生產(chǎn)工廠。如本單位已經(jīng)研制出了獼猴桃雄株花粉加工專用設(shè)備、制定了花粉生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、輔助授粉器，該項(xiàng)目成果已在生產(chǎn)中進(jìn)行了廣泛的推廣應(yīng)用。

3.3 加強(qiáng)基因組學(xué)技術(shù)在獼猴桃育種中的應(yīng)用

生物技術(shù)育種取得的系列研究進(jìn)展，特別是中華獼猴桃‘紅陽(yáng)’基因組測(cè)序成果的發(fā)表，為實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇和不同獼猴桃種質(zhì)資源有利性狀的基因滲入培育新品種奠定了基礎(chǔ)，加速了獼猴桃分子育種的進(jìn)程，給獼猴桃育種提供了新的發(fā)展機(jī)遇。在獼猴桃基因組學(xué)育種實(shí)踐中，建議可考慮以下幾方面工作：（1）功能標(biāo)記是可用于育種工作的一種理想標(biāo)記，功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是以克隆基因序列、標(biāo)記與特定性狀的關(guān)系為前提的，該標(biāo)記可用于親本鑒定、育種后代材料的基因檢測(cè)以及分離世代抗病性和品質(zhì)性狀的選擇；（2）利用基因標(biāo)記開(kāi)展聚合育種，如聚合抗?jié)儾』蚝职卟〉幕?，以增加品種的多抗性和持久性；（3）利用流式細(xì)胞儀開(kāi)展倍性育種，利用不同倍性親本雜交可以提高結(jié)實(shí)率，不同雜交組合的雜交親和性與親本的基因型有關(guān)，特別是母本的基因型，因此在雜交后代進(jìn)行倍性鑒定開(kāi)展早期定向選擇育種是非常有意義的。

3.4 加強(qiáng)獼猴桃生態(tài)學(xué)研究

生態(tài)學(xué)是一個(gè)廣義的概念，而獼猴桃生態(tài)學(xué)屬于相對(duì)狹義的范疇，其可以描述為野生獼猴桃種質(zhì)資源賴以生存的自然生態(tài)環(huán)境，以及獼猴桃栽培品種適生的氣候和土壤等生態(tài)環(huán)境因子共同構(gòu)成的一個(gè)綜合體。隨著獼猴桃品種的多樣化發(fā)展，對(duì)新培育品種的生態(tài)適應(yīng)性提出了更高的要求；另一方面，隨著全球氣候的變暖，水澇災(zāi)害時(shí)有發(fā)生，加上水肥的使用不合理，進(jìn)一步阻礙了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。因此，提高獼猴桃果園水肥利用效率，實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)有面積上通過(guò)改變果園微生態(tài)環(huán)境提高其生物學(xué)產(chǎn)量是一個(gè)亟需研究解決的新課題。

相比于蘋(píng)果等大宗果樹(shù)而言，獼猴桃科學(xué)研究起步相對(duì)較晚，研究深度也較淺。今后可考慮從以下6個(gè)方面全面、系統(tǒng)、科學(xué)的加強(qiáng)獼猴桃基礎(chǔ)研究：（1）種質(zhì)資源和分類：如野生獼猴桃資源調(diào)查及其在雜交育種中的應(yīng)用、特異資源的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)、多倍性遺傳多樣性及在品種保護(hù)中的利用；（2）營(yíng)養(yǎng)和生理：如微量元素等噴施對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響、土壤障礙因子對(duì)果樹(shù)產(chǎn)量的影響、果實(shí)軟熟期果皮形態(tài)特征變化、淀粉累積和糖分代謝特征；（3）遺傳和育種：倍性遺傳與多倍體育種、遠(yuǎn)緣雜交育種選育目標(biāo)性狀新品種、修剪方法對(duì)果樹(shù)光合和果實(shí)特征的影響；（4）采后生物學(xué)：如外源激素（乙烯和臭氧）對(duì)獼猴桃果實(shí)儲(chǔ)藏期及其蛋白質(zhì)組的影響；（5）抗蟲(chóng)和抗?。喝绔J猴桃抗?jié)儾?、根腐病和病蟲(chóng)害控制；（6）生產(chǎn)、管理和市場(chǎng)：春季修剪時(shí)間對(duì)獼猴桃產(chǎn)量和質(zhì)量的影響；潰瘍病對(duì)獼猴桃企業(yè)的影響。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Biotechnology and Kiwifruit Breeding in China

Jing Zhaobin1，2Lei Yushan1，2，3Li Yongwu2，3
（1. Shaanxi Rural Science and Technology Development Center，Xi’an 710054；2. Xi’an Kiwifruit Experiment Station of Shaanxi Province，Xi’an 710054；3.Hanzhong Kiwifruit Research Institute of Shaanxi Province，Hanzhong 723500）

Kiwifruit（Actinidia Lindl.）is an important fruit tree crop in China. With the development of modern biotechnology，traditional breeding of kiwifruit is mainly based on the selection from wilding and seedling，these methods presents coexist situation the challenge and opportunity compared with the application of molecular breeding such as the genomics and transgenesis. Compared with the other fruit trees，the researches for the genomics of kiwifruit are still at a relatively low level. This paper summarized the method，application，and the latest research progress of modern biotechnology in kiwifruit genetic breeding，and discussed the breeding strategy of kiwifruit in China，in order to provide the method and thought reference for kiwifruit conversional and transgenesis breeding in China.

Actinidia；genome； transgene； breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.036

2015-01-21

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2014BAD16B05-3），國(guó)家國(guó)際合作專項(xiàng)項(xiàng)目（S2015ZR1042），陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2012KTJD03-01），陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014JM3077），陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃工程（2015KTZDNY02-03-01）

井趙斌，男，博士，研究方向：獼猴桃育種與生理生態(tài)；E-mail：zxxjzb520@gmail.com

雷玉山，男，碩士，研究方向：獼猴桃育種；E-mail：leiyush@163.com