曹月霞 凌鍵 謝丙炎 楊宇紅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

西瓜枯萎病菌的快速檢測與鑒定

曹月霞 凌鍵 謝丙炎 楊宇紅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

通過西瓜枯萎病菌與其他?；涂菸【肮项悗追N重要病原菌的比較基因組分析，獲得了西瓜枯萎病菌的基因組特異序列。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計出特異引物，篩選可擴(kuò)增出西瓜枯萎病菌特異性DNA條帶的引物。將特異性引物和尖孢鐮刀菌?；偷耐ㄓ靡颳106R/W106S結(jié)合，建立雙重PCR檢測體系。該雙重PCR檢測體系可以在一次PCR反應(yīng)中快速、準(zhǔn)確的檢測出西瓜枯萎病菌，為通過分子方法快速鑒定西瓜枯萎病菌提供技術(shù)支持。

西瓜枯萎病菌；雙重PCR；尖孢鐮刀菌

西瓜枯萎病俗稱蔓割病或萎蔫病，是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起的一種世界性瓜類土傳病害［1-3］。它的發(fā)生極為普遍，對西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，是西瓜生產(chǎn)上的重要病害。目前，對這類維管束病害的有效防治方法主要是依靠抗病品種選育，但可供選育的抗病品種抗源單一，效率不高。趙麗明等［4］從西瓜根際土壤中篩選出對西瓜枯萎病菌防治效果好、無污染土壤中生存良好的放線菌菌株XF9、XF18和XF22，能較好的防治西瓜枯萎病。3種有益微生物為生物農(nóng)藥的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也為西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗機制奠定了理論基礎(chǔ)。國際上公認(rèn)的西瓜枯萎病菌有3個生理小種，即生理小種0號、1號和2號，其中2號生理小種的侵染性最強［5-7］。除以上3個生理小種外，還有其他的小種分化，生理小種3于2010年鑒定分離［8］，但在中國尚未見報道，需進(jìn)一步證實。傳統(tǒng)上對西瓜枯萎病菌的鑒定主要是采用形態(tài)特征的比較法，即對不同地區(qū)的西瓜枯萎病菌分離物進(jìn)行形態(tài)特征（如菌落顏色、菌落密度、大小孢子的大小與形狀及菌落直徑等）的比較。但利用傳統(tǒng)的鑒定方法來鑒別病原菌準(zhǔn)確性不高，已不能滿足生產(chǎn)的要求。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括AFLP、RFLP、RAPD及SCAR在內(nèi)的分子檢測技術(shù)在病原菌鑒定［9］、分類［10］及群體遺傳多樣性［11］研究中得到植物病理學(xué)家的高度重視。基于特異基因組設(shè)計的特異性引物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的分子檢測，前人基于特異性引物成功建立了快速檢測雙重PCR技術(shù)已用于檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌［12］、小麥條紋花葉病毒和小麥花葉病毒［13］等植物病原菌的分子鑒定體系。目前在尖孢鐮刀菌的分子檢測方面，Zhang等［14］利用甘藍(lán)枯萎病菌特異性引物Focs-1/Focs-2和尖孢鐮刀菌通用引物W106R/W106F建立了檢測甘藍(lán)枯萎病菌的多重PCR檢測體系。該技術(shù)既可應(yīng)用于甘藍(lán)枯萎病發(fā)病區(qū)病情的檢測，也可從發(fā)病植株中檢測出甘藍(lán)枯萎病菌。而對于西瓜枯萎病菌的分子檢測，Zhang等［15］把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2對特異性引物Fn-1/Fn-2 和Mn-1/Mn-2置于同一反應(yīng)中，建立了檢測西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的雙重 PCR 體系。但雙重PCR檢測西瓜枯萎病菌和其他病原菌的方法在國內(nèi)外都未見報道。

本研究擬通過設(shè)計西瓜枯萎病菌的特異引物，與尖孢鐮刀菌的通用引物W106R/W106S結(jié)合，建立雙重PCR檢測體系，對西瓜枯萎病菌、尖孢鐮刀菌其他專化型菌株和其他外圍菌株進(jìn)行?；詸z測，以期為該病的預(yù)測預(yù)報并及時采取有效的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試菌株包括西瓜枯萎病菌的3個小種共7個菌株、尖孢鐮刀菌其他?；偷?0個菌株和其他5個外圍菌株。其種名、來源及數(shù)量，見表1。

表1 供試西瓜枯萎病菌菌株的來源

1.2 方法

1.2.1 供試菌株培養(yǎng) 西瓜枯萎病菌在PDA培養(yǎng)基上（28℃）培養(yǎng)72 h后，從菌落的邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)至PDB液體培養(yǎng)基中（150 r/min，28℃）振蕩培養(yǎng)3 d過濾收集菌絲，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的提取 用改良的CTAB法［16］提取病原菌的DNA。

1.2.3 引物的設(shè)計 根據(jù)西瓜枯萎病菌的基因組序列，比對近緣種以及其他不同致病菌的序列同源性，通過基因組BLAST的方法找到西瓜枯萎病菌的特異片段。用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計出10對引物，詳況，見表2。

表2 待篩選的生物序列

1.2.4 引物的PCR擴(kuò)增 引物檢測西瓜枯萎病菌的PCR反應(yīng)總體系是25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR的反應(yīng)程序是：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%（50×TAE）瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.5 引物的特異性檢測 用合成的引物對供試菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性，PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序同上。

1.2.6 雙重PCR體系的建立 利用設(shè)計的檢測西瓜枯萎病菌的特異性引物與尖孢鐮刀菌其他?；途甑耐ㄓ靡颳106R/W106S［17］結(jié)合，建立雙重PCR體系。通用引物W106R/W106S的序列為W106R（5'-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3'）和W106S（5'-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3'），該引物使尖孢鐮刀菌其他?；途陻U(kuò)增出一條729 bp的特異性條帶［17］。

雙重PCR反應(yīng)總體系為25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，西瓜枯萎病菌的特異引物（10 μmol/L）各1 μL，通用引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%（50×TAE）瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 引物的特異性篩選

利用設(shè)計的10對西瓜枯萎病菌特異性引物對供試的7個西瓜枯萎病菌菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖1）顯示，只有1、2、3、4和6號引物均可以產(chǎn)生比較單一的條帶，而其他的引物則不能產(chǎn)生單一的條帶，說明上述5對引物均具有較強特異性。

圖1 利用編號為1至10的引物和通用引物W106R/ W106S擴(kuò)增的特異性條帶

2.2 特異性引物的檢測

對篩選出的5對引物和供試的7個西瓜枯萎病菌菌株、10個尖孢鐮刀菌其他?；途旰?個外圍菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以ddH2O為對照。結(jié)果顯示，1、2、3、4和6號引物可以使西瓜枯萎病菌產(chǎn)生相應(yīng)的單一條帶（圖2，泳道1-7），而在尖孢鐮刀菌其他?；途旰屯鈬曛芯荒墚a(chǎn)生條帶（圖2，泳道8-22）。通用引物可以使西瓜枯萎病菌和尖孢鐮刀菌其他?；途陻U(kuò)增出729 bp的條帶（圖2，泳道1-17），表明上述引物均具有特異性。

圖2 利用編號為1、2、3、4、6的引物和通用引物W106R/W106S擴(kuò)增的特異性條帶

2.3 雙重PCR檢測

以5對特異性引物和通用引物（W106R/W106S）對7個西瓜枯萎病菌菌株以及15個對照菌株的基因組DNA進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，以ddH2O為對照。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示，西瓜枯萎病菌可以產(chǎn)生兩條不同的條帶（圖3，泳道1-7，1-17），尖孢鐮刀菌其他?；途曛划a(chǎn)生一條729 bp的條帶（圖3，泳道8-17），而外圍菌株和無菌水不能擴(kuò)增出條帶（圖3，泳道18-23）。研究結(jié)果顯示，雙重PCR檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致，也進(jìn)一步證明雙重PCR檢測技術(shù)的可靠性。

圖3 利用編號為2、3、4、6的引物和通用引物W106R/ W106S擴(kuò)增的特異性條帶

3 討論

雙重PCR（Duplex PCR）是在一個PCR反應(yīng)體系中加入兩對特異性引物，同時擴(kuò)增2個目的基因，能夠在一個PCR反應(yīng)中檢測出兩種病原菌，提高效率，而且還可以減少因?qū)嶒灢僮魉鶐淼募訇栃缘葐栴}，能很好地用于植物病原菌間的檢測。建立雙重 PCR 體系的關(guān)鍵是引物設(shè)計［18］，雙重PCR反應(yīng)中引物之間不可以發(fā)生相互作用，形成引物二聚體和非特異性的擴(kuò)增。同時，二者擴(kuò)增的片段長度要有一定的差距，電泳檢測可以產(chǎn)生不同的條帶。因此，雙重PCR體系的建立很重要［19，20］。

檢測不同植物病原菌的雙重PCR反應(yīng)在國內(nèi)外均有報道，如陳慶河等［21］利用馬鈴薯晚疫病菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計了一對特異性引物INF1/INF2，與馬鈴薯青枯病菌特異性引物 759/760 組合建立雙重 PCR 體系。Diallo 等［22］建立了檢測胡蘿卜軟腐果膠桿菌馬鈴薯黑脛病亞種和菊亞種的雙重 PCR體系，能夠快速的對兩種病原菌進(jìn)行分子檢測。Majumder 等［23］建立了檢測洋蔥黃矮病毒和蔥潛隱病毒的雙重 PCR 體系，該體系是在 RNA 水平上對洋蔥黃矮病毒和蔥潛隱病毒進(jìn)行檢測。

前人應(yīng)用雙重PCR方法只能檢測出西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌，而針對西瓜枯萎病菌與尖孢鐮刀菌其他?；偷牟≡推渌≡姆肿訖z測尚未報道。在本研究中，通過對西瓜枯萎病菌的全基因組測序，比對近緣種以及瓜類上幾種重要病原菌的基因組序列，設(shè)計并篩選能擴(kuò)增出西瓜枯萎病菌特異性DNA條帶的引物。本研究設(shè)計的特異引物能夠快速而準(zhǔn)確的檢測西瓜枯萎病菌，在西瓜枯萎病菌潛伏期和發(fā)病初期對其進(jìn)行診斷、監(jiān)測和病原菌鑒定，以便采取有效的防治方法，及時控制病害的傳播和蔓延，減少經(jīng)濟(jì)損失，在實際生產(chǎn)上具有重要的指導(dǎo)作用。雙重PCR具有效率高、成本低等優(yōu)點，具有非常廣闊的實際應(yīng)用價值，同時本研究也為其他植物病害雙重PCR檢測方法的建立奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究建立了一種雙重PCR檢測體系，通過設(shè)計和應(yīng)用引物Fon-2R/ Fon-2F、Fon-3R/ Fon-3F、Fon-4R/ Fon-4F 和Fon-6R/ Fon-6F能檢測出西瓜枯萎病菌。該檢測體系具有高效、準(zhǔn)確及經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)點，適用于西瓜田間土壤的帶菌檢測以及西瓜枯萎病菌的檢驗檢疫和有效防治。

［1］Zheng Q， Bi Y， Yun XM， et al. Research progress on watermelon blight and its control［J］. Plant Protection， 2007， 27（2）：11-12.

［2］Ding JC， Zhang QA， Fang L. Identification of resistance of watermelon varieties to Fusarium Wilt［J］. Chinese Vegetable，2005（6）：27-29.

［3］Gu WH， Wang YH， Song RH. Preliminary study on Fusarium wilt pathogen races in Shanghai area［J］. Acta agriculture Shanghai，1994， 10（3）：63--67.

［4］趙麗明， 丁延芹， 路曉萌， 等. 西瓜根際枯萎病拮抗放線菌的篩選及鑒定［J］. 生物技術(shù)通報， 2010（5）：107-110.

［5］Martyn RD. Fusarium oxysporum f. sp. niveum Race 2：A highly aggressive new race to the United States［J］. Plant disease， 1987（3）：71-73.

［6］Martyn RD， Netzer D. Resistance to races 0， 1， and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI296341-FR［J］. Hortscience，1991， 26：429-432.

［7］Wang HB， Wang M. Study of physiological races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum［J］. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 1993， 2（4）：67-70.

［8］Zhou XG， Everts KL， Bruton BD. Race 3， a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon［J］. Plant disease， 2010， 94（1）：92-98.

［9］Nicholson P， Kezanoor HZ， 蘇海. 用RAPD分析和DNA指紋鑒別玉米小斑病菌O.C.T三個小種 ［J］. 植物病理學(xué)報， 1993， 23（2）：114.

［10］Alalounakis DJ， Fragkiadakis GA. Genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates from cucumber：differentiation by pathogenicity，vegetative compatibility and RAPD fingerprinting ［J］. Ecology and Population Biology， 1999， 89（2）：161-168.

［11］ Tooley PW， O’Neill NR， Goley ED， et al. Assessment of diversity in Claviceps Africana and other Claviceps species by RAM and AFLP analyses ［J］. Phytopathology， 2000， 90：1126-1130.

［12］ 馮雯杰， 常清樂， 楊龍， 等. 水稻葉枯病和細(xì)菌性條斑病菌的分子標(biāo)記篩選檢測［J］. 植物病理學(xué)報， 2013， 43（6）：581-589.

［13］Price JA， Smith J， Simmons A， et al. Multiplex real-time RT-PCR for detection of Wheat streak mosaic virus and Tritcum mosaic virus［J］. Journal of Virological Methods， 2010， 165（2）：198-201.

［14］張吉祥， 凌鍵， 謝丙炎， 等.甘藍(lán)枯萎病菌1號和2號生理小種的快速檢測與鑒定［J］.植物病理學(xué)報， 2014， 44（6）：586-594.

［15］Zhang Z， Zhang J， Wang Y， et al. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil［J］. FEMS Microbiology Letters. 2005， 249（1）：39-47.

［16］Liu D， Coloe S， Baird R， et al. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR ［J］. Journal of Clinical Microbiology， 2000， 38（1）：471.

［17］LI MH， Yu HT， Wang HF， et al. Rapid Detection and Identification of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 1 and Race 4（in Chinese）［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2012， 45（19）：3971-3979.

［18］Henegariu O， Heerema NA， Dlouhy SR， et al. Multiplex PCR：critical parameters and step-by-step protocol［J］. Biotechniques，1997， 23（3）：504-511.

［19］Gilbert SA， Burton KM， Prins SE， et al. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR［J］. Journal of Clinical Microbiology， 1999， 37（6）：2020.

［20］Kent L， Mchugh TD， Billington O， et al. Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp.［J］. Journal of Clinical Microbiology， 1995，33（9）：2290.

［21］Cheng QH， Li BJ， Lan CZ， et al. Development and application of duplex PCR assay for detection of Phytophthora infestans and Ralstonia solanacearum［J］. Acta Phytopathologica Sinica， 2009，39（6）：578-583.

［22］Diallo S， Latour X， Groboillot A， et al. Simultaneous and selective detection of two major soft rot pathogens of potato：Pectobacterium atrosepticum（Erwinia carotovora subsp. atrosepticum）and Dickeya spp.（Erwinia chrysanthemi）［J］. European Journal of Plant Pathology， 2009， 125（2）：349-354.

［23］Majumder S， Baranwal VK， Joshi S. Simultaneous detection of Onion yellow dwarf virus and Shallot latent virus in infected leaves and cloves of Garlic by duplex RT-PCR［J］. Journal of Plant Pathology， 2008， 90（2）：371-374.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Rapid Detection and Identification of Fusarium oxysporum f. sp. niveum

Cao Yuexia Ling Jian Xie Bingyan Yang Yuhong
（Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Based on the genome comparison analysis between Fusarium oxysporum f. sp. niveum（Fon）and other closely-related pathogens， the specific sequences of Fon were obtained. Then we developed specific primers that could amplify Fon-specific DNA bands. Combined the Fon-specific primers with the universal primer of Fusarium oxysporum （W106R/W106S）， we established a duplex PCR method that might rapidly and accurately detect Fon by 1 PCR reaction， which is beneficial to technically support the rapid identification of Fon by method of molecular detection..

Fusarium oxysporum f. sp. niveum；duplex PCR；Fusarium oxysporum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.009

2014-11-05

國家自然科學(xué)基金項目（31272003），國家科技支撐計劃“果蔬重大病蟲害防控技術(shù)研究與集成示范（2012BAD19B06），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903049），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）

曹月霞，女，碩士研究生，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：caoyuexia815@163.com

凌鍵，男，副研究員，研究方向：植物病理學(xué)；E-mail：lingjian2005@126.com