馬浪浪梁振娟先新羅仕文李清超梁黔云

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，成都 611130；2. 畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，畢節(jié) 551700）

基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)全基因組DNA甲基化水平的方法

馬浪浪1，2梁振娟2先新2羅仕文2李清超2梁黔云2

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，成都 611130；2. 畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，畢節(jié) 551700）

DNA甲基化的研究最近幾年一直是表觀遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)。有關(guān)DNA甲基化水平檢測(cè)的方法大體上有十幾種，隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在全基因組水平上對(duì)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。目前，基于第二代高通量測(cè)序進(jìn)行全基因組DNA甲基化水平檢測(cè)的方法主要有BSP-seq（亞硫酸氫鹽修飾結(jié)合直接測(cè)序法）、MeDIP-seq（甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序法）、MBD-seq（甲基化DNA富集結(jié)合高通量測(cè)序法）。就這3種方法在原理、流程、優(yōu)缺點(diǎn)、優(yōu)化使用及后期需要用到的部分生物信息學(xué)資源等方面的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為研究者在采用高通量測(cè)序方法研究DNA甲基化模式時(shí)提供一些思路。

高通量測(cè)序技術(shù)；全基因組；DNA甲基化水平；BSP-seq；MeDIP-seq；MBD-seq

表觀遺傳學(xué)的研究日益深入，作為其中重要一方面的DNA甲基化更是長(zhǎng)期研究的熱點(diǎn)。人們?cè)絹?lái)越清楚地認(rèn)識(shí)到有關(guān)DNA甲基化的研究很有可能在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生重大變革。

1 DNA甲基化的基本特征及維持機(jī)制

DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶或腺嘌呤上，從而對(duì)DNA進(jìn)行修飾，進(jìn)而發(fā)生一系列的表觀修飾現(xiàn)象［1］。

與其他研究相似，人們對(duì)于植物DNA甲基化修飾的研究始于模式植物擬南芥，擬南芥全基因組甲基化圖譜（單核苷酸分辨率）已經(jīng)公布［2-4］。研究表明，在植物中發(fā)生DNA甲基化修飾的區(qū)域主要有CpG島、CHH、CHG（H代表A或T）以及轉(zhuǎn)錄區(qū)域、基因主體上［2-7］。發(fā)生于CpG島、CHH、CHG區(qū)域的DNA甲基化修飾主要生物學(xué)功能為：通過(guò)產(chǎn)生甲基化重復(fù)序列來(lái)抑制基因組DNA，從而達(dá)到保護(hù)基因組的目的；發(fā)生于轉(zhuǎn)錄區(qū)域、基因主體區(qū)域的DNA甲基化修飾主要生物學(xué)功能為：通過(guò)甲基化水平的高低調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平。一系列研究都表明，基因的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)性［4，6，8］。

DNA甲基化能引起一系列表觀遺傳修飾現(xiàn)象：植物開(kāi)花、衰老、抗逆、基因沉默及雜種優(yōu)勢(shì)等。如Sheldon等［9］研究表明抽薹相關(guān)基因的甲基化水平降低，可以造成植物提取開(kāi)花。Fraga等［10］研究發(fā)現(xiàn)成年輻射松植株的甲基化程度明顯高于幼年植株的甲基化程度。Roberta等［11］對(duì)三葉草根系、大麻根系進(jìn)行重金屬處理后發(fā)現(xiàn)它們的基因組DNA甲基化水平均降低。Peerbolte等［12］研究表明在T-DNA上的冠癭堿基因發(fā)生甲基化作用，使得該基因在隨后的轉(zhuǎn)化過(guò)程中沉默。孫其信［13］對(duì)植物分別進(jìn)行自交、雜交，結(jié)果表明自交后基因組DNA甲基化水平增加，雜交后基因組DNA甲基化水平降低。本課題組以玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程為切入點(diǎn)，對(duì)該過(guò)程中不同時(shí)期全基因組DNA甲基化模式進(jìn)行了分析（運(yùn)用了甲基化DNA免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，即MeDIP-seq，該技術(shù)將會(huì)在后文闡述），得出了在這一過(guò)程中DNA甲基化水平的變化情況，具體研究結(jié)果待發(fā)表。以上幾個(gè)例子表明：在一系列的生物學(xué)過(guò)程中都有DNA甲基化的參與，隨著研究方法、技術(shù)的提高，研究者對(duì)于DNA甲基化參與表觀遺傳修飾的研究必將更加深入。

目前，有關(guān)DNA甲基化的維持機(jī)制主要基于4類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行作用。如MET1甲基轉(zhuǎn)移酶在DNA復(fù)制過(guò)程中能識(shí)別單拷貝及重復(fù)序列的CG位點(diǎn)，使得在該CG位點(diǎn)發(fā)生甲基化作用［14，15］；DRM重新甲基化酶則是在小分子RNA介導(dǎo)下識(shí)別胞嘧啶序列，進(jìn)而發(fā)生重新甲基化作用，即RdDM［16，17］；CMT染色質(zhì)甲基化酶可以特異性作用于異染色質(zhì)區(qū)的CNG序列，進(jìn)而發(fā)生甲基化作用，該酶在植物中特有存在［18-20］；研究者認(rèn)為DNMT2家族的一些同系物可能也參與甲基化的維持機(jī)制，具體方式有待進(jìn)一步研究［21］。這幾類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶有時(shí)也并非獨(dú)立參與機(jī)制的調(diào)控，它們常常相互作用，共同參與機(jī)制的調(diào)控。我們相信，隨著研究技術(shù)的不斷提升，研究者對(duì)于DNA甲基化的維持機(jī)制將會(huì)有更加全面的認(rèn)識(shí)。

2 基于全基因組進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)的方法

目前，研究者對(duì)于DNA甲基化的檢測(cè)方法主要可以分為兩個(gè)層面：（1）基于全基因組DNA甲基化水平檢測(cè)；（2）基于片段（位點(diǎn)）DNA甲基化檢測(cè)?；谌蚪MDNA甲基化的檢測(cè)方法，見(jiàn)表1。

上述基于基因組DNA甲基化的研究方法中，BSP-seq、MeDIP-seq和MBD-seq這3種方法隨著全基因組高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及生物信息學(xué)的興起，在人們的研究中越來(lái)越受到重視。故下文主要針對(duì)這3種方法進(jìn)行介紹。

2.1 三種檢測(cè)方法的工作流程

2.1.1 BSP-seq法檢測(cè)DNA甲基化水平 BSP-seq法最早是由Frommer等［28］提出，其檢測(cè)DNA甲基化的原理已在表1中介紹。該方法的檢測(cè)流程如下：（1）基因組DNA的提取、檢測(cè)、純化（保證DNA的質(zhì)量、純度等）；（2）用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA；（3）對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行回收并純化；（4）引物設(shè)計(jì)（根據(jù)目的基因啟動(dòng)子序列）；（5）PCR擴(kuò)增目的片段；（6）PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序；（7）對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)、對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析［28，31］。

運(yùn)用BSP-seq檢測(cè)DNA甲基化需要注意的問(wèn)題：（1）樣品的質(zhì)量應(yīng)適中，DNA量太多會(huì)造成亞硫酸鹽修飾不完全，DNA量太少則會(huì)造成后期實(shí)驗(yàn)回收量不足；（2）在亞硫酸鹽修飾過(guò)程中必須保證pH值絕對(duì)準(zhǔn)確、且需要多次摸索合適的反應(yīng)時(shí)間；（3）因?yàn)樵撨^(guò)程涉及到PCR擴(kuò)增，故引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)體系都需不斷優(yōu)化［32］。此外，在后期數(shù)據(jù)處理時(shí)可能會(huì)碰到一些問(wèn)題，如由于測(cè)序錯(cuò)誤、污染等情況，得到的數(shù)據(jù)處理時(shí)比較麻煩。針對(duì)這些情況，Krueger等［33］給出一些處理方法，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提高。

表1 基于全基因組進(jìn)行DNA甲基化的檢測(cè)方法

2.1.2 MeDIP-seq法檢測(cè)DNA甲基化水平 MeDIP-seq法是由Weber等［34］在2005年首先提出，是指5'-甲基胞嘧啶抗體特異富集基因組DNA上發(fā)生甲基化的片段，之后通過(guò)對(duì)這些富集的甲基化片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從而獲得基因組DNA的甲基化發(fā)生區(qū)域、甲基化水平等。具體操作流程為：（1）通過(guò)超聲波將DNA打斷成DNA片段；（2）通過(guò)高溫使得片段DNA解為單鏈；（3）片段DNA與5'-甲基胞嘧啶抗體特異反應(yīng)，從而構(gòu)建甲基化DNA文庫(kù)（這一過(guò)程伴隨著對(duì)片段DNA進(jìn)行PCR等處理）；（4）高通量測(cè)序及后期對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析（測(cè)序數(shù)據(jù)去污染、去接頭、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)產(chǎn)出量；測(cè)序序列與參考基因組序列比較；測(cè)序數(shù)據(jù)在基因組的分布；測(cè)序數(shù)據(jù)富集區(qū)（Peak區(qū)）的信息統(tǒng)計(jì)；基于Peak進(jìn)行全基因組甲基化差異分析等）［29，34］。運(yùn)用該方法進(jìn)行基因組DNA甲基化檢測(cè)需要注意：（1）DNA片段富集過(guò)程中富集條件必須摸索才能達(dá)到好的效果；（2）DNA片段富集后，當(dāng)富集量較少時(shí)需采用PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系需不斷優(yōu)化；（3）要保證樣品在整個(gè)測(cè)序過(guò)程中無(wú)污染等［35］。

2.1.3 MBD-seq法檢測(cè)DNA甲基化水平 MBD-seq法檢測(cè)基因組DNA甲基化水平的原理與MeDIP-seq法基本相似。其檢測(cè)流程如下：（1）特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段；（2）對(duì)富集的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平得到平末端片段；（3）對(duì)平末端片段進(jìn)行末端加A'，得到3'-dA黏性末端；（4）加連接頭，獲得帶接頭片段，進(jìn)而得到長(zhǎng)度合適的目的DNA片段；（5）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建MBD-seqDNA文庫(kù)；（6）進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析［30］。

近年，研究者采用該方法對(duì)DNA甲基化模式進(jìn)行了大量的研究，如Wang等［36］采用MBD-seq法分析家族腺瘤性息肉癥患者在BRB栓劑的治療下的甲基化狀態(tài)顯示，在該栓劑的作用下出現(xiàn)較多的脫甲基轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)；家族腺瘤性息肉癥患者的息肉減少。綜合該結(jié)果表明，家族腺瘤性息肉癥可能與脫甲基化轉(zhuǎn)錄相關(guān)。運(yùn)用該方法進(jìn)行基因組DNA甲基化水平檢測(cè)時(shí)，需要注意的問(wèn)題同運(yùn)用MeDIP-seq法需要注意的問(wèn)題基本相似。

2.2 三種檢測(cè)方法的比較及優(yōu)化使用

BSP-seq、MeDIP-seq、MBD-seq這3種基于高通量測(cè)序檢測(cè)全基因組DNA甲基化方法在費(fèi)用、分辨率、數(shù)據(jù)分析等方面有一定的差異。表2是就BSP-seq、MeDIP-seq和MBD-seq這3種方法在這些方面的差異進(jìn)行的總結(jié)。

表2 三種基于高通量測(cè)序檢測(cè)全基因組DNA甲基化方法比較

由于BSP-seq法既可得到全基因組上的甲基化信息，又可得到特異位點(diǎn)上的甲基化信息，故此法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。但對(duì)于基因組較大的物種而言，該方法花費(fèi)巨大，且高通量測(cè)序數(shù)據(jù)也很龐大，對(duì)于后期數(shù)據(jù)處理、分析提出了挑戰(zhàn)。因此，研究者在實(shí)際操作中往往很難接受或采用該方法。MeDIP-seq法及MBD-seq法測(cè)序費(fèi)用相對(duì)較低，數(shù)據(jù)量較小，但分析得到的結(jié)果很難驗(yàn)證?；谏鲜鲈?，科研工作者進(jìn)行了大量的改進(jìn)嘗試。如Li等［38］采用BSP-seq法得出人類(lèi)外周血單核細(xì)胞中的一個(gè)單堿基分辨率甲基化組，并以此圖譜作為參考基因組對(duì)比了MeDIP-seq法及MBD-seq法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，MeDIP-seq對(duì)高度甲基化、高CpG密度更加敏感；MDB-seq對(duì)高度甲基化、中等CpG密度更加敏感。因此，這兩種方法可以形成很好的互補(bǔ)效應(yīng)。

2.3 三種檢測(cè)方法所涉及的生物信息學(xué)分析資源BSP-seq、MeDIP-seq、MBD-seq這3種方法在經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序后得到大量的數(shù)據(jù)。對(duì)于這些數(shù)據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，才能得到研究者理想的結(jié)果，詳見(jiàn)表3。

表3 部分生物信息學(xué)分析資源

3 展望

隨著第二代高通量測(cè)序的發(fā)展，人們將在越來(lái)越多的領(lǐng)域中使用它。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)中重要的一個(gè)方面，在近幾年的研究中借助第二代高通量測(cè)序技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。采用高通量測(cè)序技術(shù)研究DNA甲基化模式將是一種趨勢(shì)。

BSP-seq、MeDIP-seq、MBD-seq是目前基于高通量測(cè)序技術(shù)研究全基因組DNA甲基化模式的3種方法。正如前文所述，這3種方法各有優(yōu)劣，結(jié)合花費(fèi)、分辨率、特異性、敏感度及數(shù)據(jù)分析等方面研究者認(rèn)為［40］：在針對(duì)一些基因組較大的物種進(jìn)行全基因組DNA甲基化模式研究中采用MeDIP-seq法和MBD-seq法相互補(bǔ)充較優(yōu)于采用BSP-seq法；而在針對(duì)一些基因組較小的物種進(jìn)行研究時(shí)，可以根據(jù)研究目標(biāo)選擇不同的方法（如需要得到高分辨率、高特異性及高敏感度等較高要求時(shí)可優(yōu)先選擇BSP-seq法，反之可選擇MeDIP-seq法或MBD-seq法）。

本課題組采用MeDIP-seq法研究了高胚誘導(dǎo)率玉米骨干自交系幼胚發(fā)育過(guò)程中全基因組DNA甲基化模式，結(jié)合近幾年擬南芥全基因組DNA甲基化已公布圖譜，筆者以為，應(yīng)以此為模式并結(jié)合優(yōu)化使用BSP-seq、MeDIP-seq、MBD-seq這3種方法開(kāi)展相關(guān)植物全基因組DNA甲基化研究，相信在不久的將來(lái)有關(guān)DNA甲基化的確切機(jī)制將會(huì)被人類(lèi)解析。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Detection Methods of Genome-wide DNA Methylation Level Based on High-throughput Sequencing Technology

Ma Langlang1，2Liang Zhenjuan2Xian Xin2Luo Shiwen2Li Qingchao2Liang Qianyun2
（1. Maize Research Institute of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130；2. Bijie Institude of Agricultural Science，Bijie 551700）

DNA methylation has been being the research focus of epigenetics study in the recent years. There are over 10 kinds of methods for detecting DNA methylation level， and detection of methylation status on genome-wide level has been achieved with the development of the NGS（Next-Generation Sequencing）. At present the major detection methods of DNA methylation level on genome-wide scope based on NGS include BSP-seq（Bisulfite Sequencing PCR）， MeDIP-seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）and MBD-seq（Methylated DNA Binding Domain Sequencing）. In this paper， the research progress of principles， procedures， advantages and disadvantages， optimization of the usage and some bioinformatics resources on these 3 methods were reviewed， which aims to provide some beneficial ideas to researchers who are studying DNA methylation models while employing methods of high-throughput sequencing.

high-throughput sequencing technology；genome-wide；DNA methylation level；BSP-seq；MeDIP-seq；MBD-seq

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.007

2014-10-19

貴州省科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目［黔科合JZ字（2014）2001號(hào)］，州省科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃項(xiàng)目［黔科合J字（2013）2002號(hào)］，貴州省畢節(jié)市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（畢科合19號(hào)）

馬浪浪，男，碩士，研究方向：表觀遺傳學(xué)；E-mail：sxyljxml@163.com

李清超，男，助理研究員，研究方向：玉米分子育種；E-mail：569733223@qq.com梁黔云，男，研究員，研究方向：玉米育種；E-mail：blqy678@163.com