余婧郭玉雙林世鋒余世洲趙杰宏
(1.貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550081;2.貴州煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司銅仁復(fù)烤廠,銅仁 554300)
多重PCR技術(shù)快速檢測烤后煙葉轉(zhuǎn)基因成分
余婧1,2郭玉雙1林世鋒1余世洲1趙杰宏1
(1.貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550081;2.貴州煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司銅仁復(fù)烤廠,銅仁 554300)
為提高煙葉轉(zhuǎn)基因成分檢測效率,建立了烤后煙葉中3種外源基因成分的多重PCR檢測技術(shù)體系,通過優(yōu)化該反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTP、rTaq酶、引物濃度及退火溫度等參數(shù),實(shí)驗(yàn)最適條件為將4對相等摩爾濃度引物預(yù)先按1∶1∶1∶1(V/V)混合,在Mg2+為1.5 mmol/L、dNTP為125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L,DNA 100 ng,退火溫度65℃,循環(huán)數(shù)35個(gè)的反應(yīng)條件下,在一次PCR反應(yīng)中便可同時(shí)檢測煙草內(nèi)源基因NR,外源基因35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPT II篩選標(biāo)記基因。優(yōu)化后的反應(yīng)體系能夠有效地檢測出轉(zhuǎn)基因烤后煙葉百分比含量為0.9%(V/V)的轉(zhuǎn)基因成分。
多重PCR;烤后煙葉;轉(zhuǎn)基因成分
煙草制品作為特殊消費(fèi)品,公眾對轉(zhuǎn)基因煙草比其他轉(zhuǎn)基因作物更加敏感,煙草作為轉(zhuǎn)基因研究的模式植物,國內(nèi)外很多科研單位已成功培育抗蟲、抗病等多種表現(xiàn)優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因煙草[1],這些實(shí)驗(yàn)材料一旦發(fā)生不規(guī)范釋放和利用,將對消費(fèi)者利益和我國煙草制品的國際形象造成重大影響。
國際上對煙草轉(zhuǎn)基因檢測的遺傳元件主要為35S啟動(dòng)子(煙草花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子)、NOS終止子(農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子)、NPT II篩選標(biāo)記基因(來自大腸桿菌,編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,卡那霉素抗性的標(biāo)記基因)[1,2],我們在對煙草轉(zhuǎn)基因研究中常用遺傳元件的篩查中[1],統(tǒng)計(jì)出這3種元件在煙草轉(zhuǎn)基因研究中的使用頻率為90%,屬于高頻使用外源基因元件,在我國,GB/T24310-2009 《煙草及煙草制品 轉(zhuǎn)基因檢測方法》[3]將這3種遺傳元件作為轉(zhuǎn)基因煙草檢測中共有序列標(biāo)志。因此,在檢測煙葉中是否含有轉(zhuǎn)基因成分時(shí),可先行檢測35S、NOS、NPT II基因是否存在來確定煙葉中是否含轉(zhuǎn)基因成分。而NR基因?yàn)闊煵輧?nèi)源基因硝酸還原酶,在PCR檢測中用以評(píng)價(jià)DNA提取質(zhì)量的可用性[4]。
在轉(zhuǎn)基因檢測方法中,PCR方法以其靈敏度高而得到廣泛認(rèn)可,定性PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因檢測中最成熟的技術(shù)之一,并且多數(shù)國家將該方法制定為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法,但是,大多數(shù)定性PCR檢測采用單一PCR技術(shù),需分別對每個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測,花費(fèi)時(shí)間較多[5]。多重PCR方法是單一PCR方法的改進(jìn),該技術(shù)在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)加入多對引物,只需一次PCR反應(yīng)便能同時(shí)檢測兩種以上靶標(biāo)序列,較單一PCR更為快捷和經(jīng)濟(jì)[6],在病毒檢測、細(xì)菌檢測、轉(zhuǎn)基因檢測中得到廣泛應(yīng)用[7]。高玉龍等[8]曾提出用于轉(zhuǎn)基因煙草檢測的多重PCR方法,但該方法是將35S與NR,NPT II與NOS分別進(jìn)行二重PCR檢測,并未在同一反應(yīng)內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)4種基因成分的檢測。本實(shí)驗(yàn)以烤后煙葉為供試材料,旨在建立通過一個(gè)PCR反應(yīng)內(nèi)便能同時(shí)檢測煙草內(nèi)源基因NR、外源基因35S啟動(dòng)子、NOS終止子及NPT II篩選標(biāo)記基因的多重PCR方法。
1.1 材料
1.1.1 供試材料 轉(zhuǎn)基因陽性烤后煙葉,非轉(zhuǎn)基因烤后煙葉由本實(shí)驗(yàn)室研制提供,其中轉(zhuǎn)基因陽性煙葉為T3代Southern檢測單拷貝陽性植株,含NPT II、35S、NOS三種已知轉(zhuǎn)基因成分??竞鬅熑~DNA提取參照GB/T 24310-2009《 煙草及煙草制品 轉(zhuǎn)基因檢測方法》[3],DNA濃度統(tǒng)一調(diào)至100 ng/μL后,轉(zhuǎn)基因煙葉DNA與非轉(zhuǎn)基因煙葉DNA按1∶99(V/V)比例混合,制成轉(zhuǎn)基因含量為1%的供試DNA。
1.1.2 試劑 rTaqTM(貨號(hào)R001A,內(nèi)含A試劑:dNTP mixture,濃度為各2.5 mmol/L,B試劑:10×PCR buffer,Mg2+濃度為15 mmol/L,C試劑:rTaq酶,5 U/μL)、100 bp DNA Ladder Marker、6×Loading Buffer為TaKaRa公司產(chǎn)品,核酸染料GelRedTM10 000×in water為BIOTIUM公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照國標(biāo)[3]引物在NCBI中檢索基因原序列,通過Primer Premier V5.0設(shè)計(jì)引物,用軟件中的Multiplex/Nested Primers功能,篩選出引物間干擾最小的引物組合,再利用Olige 6.0對設(shè)計(jì)引物Tm值進(jìn)行評(píng)估,確定最終引物序列,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物
1.2.2 單一PCR檢測 單一PCR反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 2 μL(Mg2+終 濃 度 1.50 mmol/L),dNTP 1 μL(dNTP終濃度125 μmol/L),上下游引物各1 μmol/L,DNA模板1 μL,rTaq酶0.2 μL,ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30,65℃退火45 s,72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物加5 μL 6×Loading Buffer,取8 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.3 多重PCR體系反應(yīng)體系建立及優(yōu)化 以上述單一PCR體系為初始反應(yīng)體系,將4對引物稀釋成相等摩爾濃度后預(yù)先按1∶1∶1∶1(V/V)混合,對Mg2+、dNTP、rTaq酶和混合引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,Mg2+濃度:0.75、1.50、2.25、3.00、3.75和4.50 mmol/L;dNTP濃度:100、125、150、175、200、225、250和275 μmol/L;rTaq酶濃度:1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U;混合引物濃度:0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 μmol/L。反應(yīng)體系均為20 μL。PCR產(chǎn)物加5 μL 6×Loading Buffer,取8 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 根據(jù)1.2.3優(yōu)化的反應(yīng)體系,分別對退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度梯度:57.5、60.0、62.5、65.0和67.5℃;循環(huán)數(shù):27、29、31、33和35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系均為20 μL。PCR產(chǎn)物加5 μL 6×Loading Buffer,取8 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.5 多重PCR檢測限確定 根據(jù)1.2.3及1.2.4優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件,按1.1.1將轉(zhuǎn)基因煙葉DNA及非轉(zhuǎn)基因煙葉DNA混合為轉(zhuǎn)基因成分含量分別為0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的DNA樣品,確定多重PCR的檢測限。
2.1 單一PCR及引物特異性驗(yàn)證
對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因煙葉內(nèi)源基因NR的擴(kuò)增結(jié)果(圖1)顯示,在137 bp處有明顯的特異性擴(kuò)增條帶,說明提取的煙葉DNA模板可用于PCR檢測。對外源基因NPT II、35S、NOS的擴(kuò)增結(jié)果可知,轉(zhuǎn)基因煙葉分別在約490 bp、345 bp和199 bp處出現(xiàn)明顯的特異性擴(kuò)增條帶,而非轉(zhuǎn)基因煙葉未見擴(kuò)增條帶,且空白對照均無條帶,說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有較好的特異性,符合PCR檢測需要,可用于下步的多重PCR檢測試驗(yàn)。
圖1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果
2.2 反應(yīng)體系各組分對多重PCR的影響
在加入不同濃度的Mg2+后,轉(zhuǎn)基因煙葉多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示,泳道2中,在Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí),4個(gè)基因的擴(kuò)增條件亮度較為一致且清晰可見,而泳道1及泳道6中,Mg2+分別為0.75 mmol/L及4.5 mmol/L時(shí),反應(yīng)條帶非常很弱,基本不可見,而其他泳道中不同Mg2+濃度的擴(kuò)增效果均沒有泳道2理想,說明10×PCR buffer中Mg2+對多重PCR反應(yīng)影響顯著,在Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最佳。圖3結(jié)果所示,在泳道1-7中,不同dNTP濃度的擴(kuò)增條帶亮度均較為一致,無顯著的非特異性擴(kuò)增條帶,但是,當(dāng)dNTP濃度達(dá)到275 μmol/L時(shí),NPT II及NR基因特異擴(kuò)增條帶可見,但35S及NOS反應(yīng)條帶亮度明顯很弱。圖4及圖5中,rTaq酶濃度及混合引物濃度在一定范圍內(nèi)的變化并未對結(jié)果有顯著影響,但rTaq酶濃度偏高時(shí),在約600 bp處有非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。
圖2 多重PCR中不同Mg2+濃度擴(kuò)增結(jié)果
圖3 多重PCR中不同dNTP濃度擴(kuò)增結(jié)果
綜合以上因素、實(shí)驗(yàn)成本及單一PCR擴(kuò)增結(jié)果,優(yōu)化后的反應(yīng)體系為4對引物預(yù)先稀釋成相等摩爾濃度后按1∶1∶1∶1(V/V)混合,在反應(yīng)中加入Mg2+1.5 μmol/L、dNTP 125 mol/L、rTaq 1 U、混合引物1 μmol/L。
圖4 多重PCR中不同rTaq酶濃度擴(kuò)增結(jié)果
圖5 多重PCR中不同混合引物濃度擴(kuò)增結(jié)果
2.3 不同反應(yīng)條件對多重PCR的影響
圖6中,退火溫度為65℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳,而65℃以下退火溫度的擴(kuò)增效果均不理想,部分條帶不清晰,而退火溫度為67.5℃時(shí),35S及NOS的特異性擴(kuò)增條件不可見,這是由于在較高退火溫度條件下這兩對引物的Tm值較低所致。圖7中,35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件為最佳循環(huán)數(shù)。
圖6 多重PCR中不同退火溫度擴(kuò)增結(jié)果
圖7 多重PCR中不同循環(huán)數(shù)擴(kuò)增結(jié)果
圖8 多重PCR中轉(zhuǎn)基因含量檢測限擴(kuò)增結(jié)果
2.4 多重PCR檢測限的確定
根據(jù)2.2及2.3的多重PCR優(yōu)化結(jié)果,最終確定該反應(yīng)的最優(yōu)條件為:體系中加入Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L,DNA 100 ng。反應(yīng)條件為:退火溫度為65℃,循環(huán)數(shù)35個(gè)。為確定本體系的檢測限,設(shè)置了轉(zhuǎn)基因含量分別為0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的多重PCR檢測,圖8中結(jié)果所示,在轉(zhuǎn)基因煙葉含量為0.9%的反應(yīng)體系中,煙草內(nèi)源基因NR及3個(gè)外源基因均得到有效擴(kuò)增,但在0.7%含量以下時(shí),外源基因目的條帶并不明顯。因此,該多重PCR反應(yīng)體系檢測限為0.9%。在本體系中,若內(nèi)源基因NR得不到有效擴(kuò)增,則表明所提取的烤后煙葉DNA可能含有PCR反應(yīng)抑制物,即外源基因無特異擴(kuò)增條帶時(shí)也不能說明該樣品便是轉(zhuǎn)基因陰性的。
多重PCR是在同一體系中加入多對引物進(jìn)行擴(kuò)增,不同引物濃度及比例、Mg2+、dNTP等都會(huì)對PCR結(jié)果造成不同程序的影響,因此設(shè)計(jì)引物時(shí)要充分考慮各引物擴(kuò)增片段大小、相互干擾、退火退度等,在選擇引物時(shí)需用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行篩選,同時(shí)需要對反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化[9],由于烤后煙葉DNA降解嚴(yán)重,DNA提取質(zhì)量是PCR檢測的關(guān)鍵[10],否則會(huì)得到假陰性結(jié)果,因此用多重PCR檢測烤后煙葉轉(zhuǎn)基因成分時(shí),有必要對內(nèi)源基因同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,我們選擇了煙草內(nèi)源硝酸還原酶基因NR作為內(nèi)源參照基因[3],以判斷所提取DNA是否適于PCR反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)所建立的多重PCR體系為定性檢測,在烤后煙葉轉(zhuǎn)基因檢測中具有較好的復(fù)重性和穩(wěn)定性,檢測極限為0.9%,而在有關(guān)多重定性PCR檢測轉(zhuǎn)基因作物的報(bào)道中[11,12],僅對所測靶標(biāo)進(jìn)行定性檢測,并未明確提出其檢測限,在提到檢測限的文獻(xiàn)中,邱良焱等[5]所建立的多重PCR體系檢測限為0.9%,Guo等[13]檢測限為80個(gè)拷貝,煙草的基因組約10 pg DNA[14],按此推算,本實(shí)驗(yàn)檢測靈敏度為90個(gè)拷貝,與其他學(xué)者的檢測極限基本相符。
值得指出的是,使用不同的陽性對照材料對檢測極限會(huì)有不同極限值,本實(shí)驗(yàn)中所使用的轉(zhuǎn)基因陽性煙葉為T3代,Southern檢測為單拷貝的材料,但在嚴(yán)格的外源轉(zhuǎn)基因檢測中,用于定量的陽性植物材料應(yīng)是拷貝數(shù)單一且穩(wěn)定,不顯示等位基因變化的DNA序列來作為陽性對照[15],因此,在目前尚未有烤后煙葉轉(zhuǎn)基因PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下,本實(shí)驗(yàn)中的檢測極限還需多家單位進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。
以烤后煙葉為材料,建立了在一個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)便能同時(shí)檢測煙草內(nèi)源基因NR、外源基因35S啟動(dòng)子、NOS終止子及NPT II篩選標(biāo)記基因的多重PCR方法,初步建立的體系檢測限為0.9%(V/V),為烤后煙葉轉(zhuǎn)基因成分篩查提供了技術(shù)支撐。
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(責(zé)任編輯 狄艷紅)
A Multiplex PCR for Rapid Detection of Genetically Modified Ingredient in Flue-cured Tobacco
Yu Jing1,2Guo Yushuang1Lin Shifeng1Yu Shizhou1Zhao Jiehong1
(1. Tobacco Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco,Guizhou Academy of Tobacco Science of CNTC,Guiyang 550081;2. Tongren Factory of Guizhou Tobacco Leaf Redrying Co.,Ltd,Tongren 554300)
In order to improve the efficiency of detecting genetically modified ingredient(GMI), we established a multiplex PCR detecting 3 exogenous gene ingredients in flue-cured tobacco. By optimizing the concentrations of Mg2+, dNTP, rTaq, and primer as well as annealing temperature in the multiplex PCR system, the result showed that the optimal conditions for the experiment were:4 pairs of primers pre-mixed in ratio of 1∶1∶1∶1(V/V), Mg2+1. 5 mmol/L, dNTP 125 μmol/L, rTaq polymerase 1 U, mixed primers 1 μmol/L, DNA 100 ng annealing temperature 65℃, and 35 reaction cycles;under the above conditions, the system detected 1 tobacco endogenous gene NR, exogenous gene 35S promoter, NOS terminator and selectable marker NPT II gene by 1 PCR reaction. In this study, the optimized multiplex PCR could efficiently detect the GMI of 0.9%(V/V)in transgenic flue-cured tobacco.
multiplex PCR;flue-cured tobacco;GMO ingredient
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.010
2014-10-30
貴州省科技支撐計(jì)劃農(nóng)業(yè)攻關(guān)[黔科合NY(2013)3020號(hào)]
余婧,女,碩士,農(nóng)藝師,研究方向:煙草轉(zhuǎn)基因檢測及煙草生物技術(shù);E-mail:yujingbio@126.com
趙杰宏,男,博士,副研究員,研究方向:煙草生物技術(shù);E-mail:zhaojiehong@126.com